幼鼠睪丸扭轉對成年期健側睪丸及性激素影響

李剛龍 馬洪 林金鳳 陳進 張中嚴 趙鵬 劉紅

(1.遵義醫科大學附屬醫院小兒外科，貴州 遵義 563003；2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

睪丸扭轉系泌尿外科常見陰囊急癥，以小兒和青少年多見[1]。睪丸扭轉后精索動靜脈血液循環障礙，發生睪丸缺血、細胞凋亡壞死等病理改變[2-3]。國內外學者對兒童睪丸扭轉研究，主要集中于短期患側睪丸方面如扭轉睪丸分子生物學變化。兒童期睪丸扭轉后，對健側睪丸生殖功能影響鮮有報道。目前一側睪丸扭轉、對側睪丸受損仍存爭議。本研究采用Turner法制作鼠性成熟前期睪丸扭轉模型(扭轉未壞死睪丸、扭轉疑似壞死睪丸、扭轉壞死睪丸)，分別采用復位和切除兩種術式，待性成熟期檢查健側睪丸組織結構和性激素(FSH、LH、T)水平，以了解健側睪丸功能。從而為臨床上兒童期睪丸扭轉正確處理，提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物、分組及飼養環境：選用SPF級3周齡雄性SD鼠，體重(85±15)g，由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。實驗動物56只，隨機分成7組，每組8只。飼養環境：實驗動物放在帶有氣溫控制和光線調節的環境[溫度：(21±2℃)；濕度(50±20)%]內飼養，并可以自由覓食、飲水。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型制作 采用Turner法制作鼠性成熟前期睪丸扭轉模型：實驗動物給予濃度為2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，建立模型如下：假手術對照組(CG)：在無菌條件下切開陰囊左側，游離并牽出左睪丸，不做任何處理后放回；4 h后再打開切口將睪丸用絲線固定，避免扭轉，縫合切口。扭轉未壞死睪丸復位組(NNTR)：左睪丸逆時針扭轉90°固定4 h復位睪丸(圖1A)；扭轉未壞死睪丸切除組(NNTO)：左睪丸逆時針扭轉90°固定4 h切除睪丸。扭轉疑似壞死睪丸復位組(SNTR)：左睪丸逆時針扭轉360°固定4 h復位睪丸；扭轉疑似壞死睪丸切除組(SNTO)：左睪丸逆時針扭轉360°固定4 h切除睪丸。扭轉壞死睪丸復位組(NTR)：左睪丸逆時針扭轉720°固定4 h復位睪丸(圖1B)；扭轉壞死睪丸切除組(NTO)：左睪丸逆時針扭轉720°固定4 h切除睪丸。扭轉睪丸處于不同狀態判定標準如下。扭轉未壞死睪丸：睪丸扭轉90°固定4 h復位，睪丸色澤正常、稍水腫，針刺睪丸即刻出血；扭轉疑似壞死睪丸：睪丸扭轉360°固定4 h復位，睪丸呈暗褐色、水腫等表現，針刺睪丸10 min內出血；扭轉壞死睪丸：睪丸扭轉720°固定4 h復位，睪丸呈發黑、壞死等表現，針刺睪丸10 min后未出血。上述全部SD鼠每天注射青霉素3萬U，連續1周。術后繼續飼養6周，即進入鼠性成熟期。采取快速脫頸法處死SD大鼠，切取健側睪丸并包埋制作石蠟塊；同時留置心臟血液離心取血清、ELISA法檢測性激素水平(卵泡刺激素FSH、黃體生成素LH及睪酮T)。

注：A.正常睪丸：顏色紅潤、無水腫；B.扭轉壞死睪丸：顏色發黑，水腫。圖1 正常睪丸與扭轉壞死睪丸

1.2.2性成熟期健側睪丸組織結構變化檢測 睪丸石蠟塊標本連續切取厚度為3～5 μm組織切片，平鋪在70℃烘片機上烘干、放入70℃恒溫箱烘烤4 h；再將切片常規二甲苯脫蠟至水、梯度酒精脫水、自來水沖洗；然后蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化；最后伊紅染液復染、中性樹脂封片，置光學顯微鏡觀察。睪丸組織損害判定標準：睪丸生精上皮完整，各級生精細胞排列有序，無生精小管萎縮為正常；睪丸生精上皮層減少，少量生殖細胞脫落管腔中為輕度損害；生精上皮層明顯減少，部分生殖細胞脫落管腔，生殖細胞排列紊亂、生精小管萎縮為睪丸組織結構損害。

1.2.3ELISA法檢測性成熟期性激素(FSH、LH及T)水平變化 采用ELISA法(酶聯免疫吸附測定)，即通過可溶性抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體，應用抗原抗體特異性結合特性、進行免疫反應定量和定性檢測，按試劑盒說明書檢測。

2 結 果

2.1性成熟期健側睪丸組織病理學變化 CG組健側睪丸曲細精管生精上皮完整、各級生精細胞排列有序，無生精小管萎縮(圖2A)。NNTR和NNTO組：健側睪丸曲細精管未出現病理改變，各層結構排列整齊(圖2B、2C)。SNTR和SNTO組：生精上皮層減少、少量生殖細胞脫落管腔(圖2D、2E)。NTR和NTO組：前者生精上皮層明顯減少、排列紊亂，生精小管萎縮(圖2F)；后者未出現組織結構改變(圖2G)，提示性成熟前期切除扭轉壞死睪丸能減輕成年期健側睪丸損傷。

注：A.曲細精管生精上皮完整、無脫落，生精細胞排列有序，層次分明(由外至內依次為精原細胞、精母細胞、精子細胞、精子)，無生精小管萎縮。B、C.睪丸曲細精管未出現組織結構改變，各層結構排列整齊。D、E.生精上皮層減少、排列不清，細胞腫脹、成熟精子少。F、G.前者生精上皮明顯減少、排列紊亂，成熟精子極少；后者未出現明顯的組織結構改變。圖2 各組大鼠健側睪丸組織組織結構變化(HE×400)

2.2性成熟期性激素水平變化 采用ELISA法檢測性激素(FSH、LH、T)水平見表1。FSH、LH在各組升高，T降低，但各性激素在NNTR與NNTO組間比較、以及SNTR與SNTO組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；性激素在NTR與NTO組間比較，NTR組FSH、LH明顯高于NTO組，T顯著低于NTO組(P<0.05)。假手術對照CG組性激素分別與NNTR、NNTO以及NTO組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；與CG組比較，SNTR、SNTO以及NTR組LH、FSH顯著升高，T顯著降低(P<0.05)。

表1 不同處理方式對鼠性成熟期血清中性激素FSH、LH、T水平

3 討 論

睪丸扭轉是小兒泌尿外科多發陰囊急癥、常需手術探查，且依據術中情況決定睪丸取舍，但在臨床實踐中，一些疑似壞死睪丸在未進行病理活檢情況下，很難判斷睪丸活力，而且患兒家屬大多不能接受切除睪丸[4-5]。對一側睪丸扭轉后，成年期對側睪丸生精功能是否受影響，以及切除扭轉睪丸還是保留扭轉睪丸、何者對生精功能影響最小？目前無統一意見。

眾所周知，組織形態結構與功能密切相關，組織形態結構決定功能的改變[6-8]。在本研究中發現：假手術對照CG組健側睪丸曲細精管生精上皮完整、無脫落，生精細胞排列有序，無生精小管萎縮；NNTR和NNTO組睪丸曲細精管結構完整、未見生精上皮脫落，未出現組織結構改變，提示扭轉未壞死睪丸組，可能血睪屏障未受到破壞，無抗精子抗體產生，所以無論切除還是復位扭轉睪丸，對側睪丸均未出現損傷；SNTR和SNTO組，均發生輕度的組織結構變化，即生精上皮減少，少量生殖細胞脫落于管腔，但未見生精小管萎縮，分析原因可能是扭轉疑似壞死睪丸因睪丸血液循環發生障礙，出現缺血再灌注損傷，產生抗精子抗體，但又因血流并未完全阻斷，抗精子抗體可以通過血液循環到達對側睪丸，從而引起對側睪丸的損傷，故無論切除抑或復位扭轉睪丸，對側睪丸均出現輕微損傷；NTR和NTO組中，前者睪丸形態學發生明顯變化，即生精上皮明顯減少，部分生殖細胞脫落于管腔，并可見生精小管萎縮，后者未出現明顯病理變化。我們推測可能原因系扭轉壞死睪丸因睪丸血流循環完全阻斷，睪丸出現缺血壞死前產生的抗精子抗體和過氧化物，當復位扭轉睪丸后血流重新灌注，發生嚴重的缺血再灌注損傷，抗精子抗體、過氧化物等通過血液循環到達對側，致使健側睪丸受損，在性成熟期精子生成的數量、質量受到損害；而切除組因沒有再灌注這一過程，抗精子抗體以及產生的過氧化物不能通過血液循環到達對側，故對側睪丸未受到損害。

生殖激素對雄性生殖功能具有重要作用[9]。睪酮(T)是最重要的雄激素，主要由睪丸Leydig細胞分泌，通過Sertoli細胞完成對生精過程的調控[10-12]。卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素(LH)對T有重要的調控作用，LH促進睪丸Leydig細胞增殖、合成分泌雄激素；FSH主要作用于睪丸生精細胞和支持細胞，與T共同參與維持生精過程[13-15]。本研究結果表明，假手術對照CG組性激素(FSH、LH、T)分別與NNTR、NNTO以及NTO組間比較，差異無統計學意義； 與SNTR、SNTO以及NTR組比較，FSH 、LH顯著升高，T在各組中顯著降低(P<0.05)。這表明性成熟前期扭轉未壞死睪丸無論切除與復位，以及扭轉壞死睪丸的切除，對性成熟期健側睪丸的生精功能無損害。進一步研究發現各性激素水平(FSH、LH、T)在NNTR與NNTO組間比較、以及SNTR與SNTO間比較，差異無統計學意義；但在NTR與NTO組間比較，差異有統計學意義，且NTR組中FSH、LH明顯高于NTO組，T明顯低于NTO組。不難看出，扭轉壞死的睪丸切除，對健側睪丸具有保護作用，分析其原因可能是睪丸扭轉后，睪丸血液循環發生障礙，血睪屏障受到破壞，睪丸出現缺血、缺氧，NO、氧自由基等增多，導致脂質過氧化產生大量活性氧(ROS)[16]；當復位扭轉壞死睪丸后，血液重新灌注，產生的有害物質通過血液循環到達健側，直接殺傷睪丸Leydig細胞，使T生成減少，并通過下丘腦-垂體-性腺軸的反饋調節，引起垂體分泌FSH、LH增加；而NTO組無這一病理過程，無Leydig細胞的損害，性激素分泌可以維持正常。此外，一側睪丸切除，對側睪丸Sertoli細胞分泌抑制素B等下降，對FSH負反饋作用減弱，促使垂體前葉分泌FSH增加，通過下丘腦-垂體-性腺軸的調控，刺激睪丸Sertoli細胞、生精細胞及Leydig細胞增殖，合成性激素增加，故性激素水平亦能維持正常水平。

綜上所述，鼠性成熟前期扭轉未壞死睪丸的復位與切除，對性成熟期健側睪丸無損傷；扭轉疑似壞死睪丸無論切除與復位，對性成熟期健側睪丸均有輕微損害，應予以保留；扭轉壞死睪丸的切除，對性成熟期健側睪丸具有保護作用，應盡可能切除。