天然低共熔溶劑超聲輔助高效提取海茸多酚與多糖的研究

＊劉玉坤 劉凌雯 孔晶 費玉清 徐林 陳正件

（珠海中科先進技術(shù)研究院有限公司 廣東 519000）

南極海茸（Durvillaea antarctica）是一種可食用的大型褐藻，對生長環(huán)境要求十分嚴苛，主要分布在南極洲、智利南海沿岸未經(jīng)任何污染的海域中。其富含膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、多糖等生物活性成分，具有良好的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化活性，預(yù)防肥胖和大腸癌等功效。因此，其在食品、醫(yī)藥以及化妝品行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。

近些年，天然低共熔溶劑（NADES）作為綠色、環(huán)保、無毒且高效溶劑，廣泛應(yīng)用在生物和化學(xué)領(lǐng)域，包括無機材料的制備、有機合成、生物提取和分析化學(xué)等方向。一般情況下，NADES由兩種天然成分組成，一種作為氫鍵受體（HBA），比如季銨鹽、膽堿和磷酸鹽等；另一種作為氫鍵供體（HBD），通常是基于天然植物的有機物，例如,氨基酸、羧酸和糖等。此外，NADES的制備也特別簡單，可以通過對混合物加熱的方式制備而成。由于氫鍵的相互作用，使得NADES可以和水混溶，具有低于任一組分的熔點和較高的黏度，并且可以有效地從植物中提取極性和非極性的天然產(chǎn)物，如藥物、香料、天然色素等。

基于上面表述的原因，本次實驗建立了一種環(huán)境友好型的提取方法，利用9種NADES作為提取劑萃取海茸的多酚和多糖，為更有利于開發(fā)利用海茸提供了理論數(shù)據(jù)依據(jù)。

1.材料與方法

(1)材料與儀器

海茸絲干貨（山東海洋食品有限公司）；左旋肉堿（美國Ark Pharm公司）；順丁烯二酸、檸檬酸、苯酚、蘋果酸、酒石酸、丙二酸、丙酸、脯氨酸、草酸、葡萄糖、丁二酸、過硫酸鉀、Vc（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水碳酸鈉（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；Folin-Ciocalteu試劑（GOLD WHEAT）；沒食子酸（上海泰坦科技股份有限公司）；濃硫酸（上海穗試公司）。

Master-Q 15去離子純水機（上海和泰儀器有限公司）；H1850臺式離心機（湖南湘儀離心機有限公司）；KQ-300E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；SynergyHTX多功能酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

(2)實驗方法

NADES的制備

將左旋肉堿與氫鍵供體（順丁烯二酸、草酸、脯氨酸、蘋果酸、丙二酸、丙酸、檸檬酸、丁二酸和酒石酸）按照試驗?zāi)柋?:1混合，加入規(guī)定質(zhì)量的去離子水，在室溫下用超聲（40kHz，30W）15～30min，直到發(fā)生成穩(wěn)定、透明、均一的NADES溶液。在本文中，選取左旋肉堿作為氫鍵受體與9種氫鍵供體合成提取劑，見表1。

表1 低共熔溶劑組成及編號Tab.1 Composition and numbering of NADES

(3)超聲輔助提取

將海茸用粉碎機打碎，過100目篩得到海茸粉末樣品，用于后續(xù)的提取實驗。

①多酚的提取

用乙醇作為對照，以料液比1:20（質(zhì)量/g:體積/mL）將海茸粉分別與9種NADES提取劑（50%含水量）以及對照提取劑裝入50mL離心管中，室溫下超聲（40kHz，30W）30min，1000rpm離心10min，取上清，得到提取液，4℃冰箱保存，待測多酚含量。

②多糖的提取

以去離子水為對照，按照上述的料液比和實驗條件進行。離心后收集上清液，向沉淀試液中加入20mL去離子水進行充分洗滌，以1000rpm離心10min，收集試液上清液，再重復(fù)洗滌三次，合并之前試驗上清液并用去離子水定容至100mL，得到多糖提取液，4℃冰箱保存，待測多糖含量。

(4)含量的測定

①沒食子酸標準曲線的繪制及多酚含量測定

準確稱取20.0mg沒食子酸，用去離子水定容至100mL，得到0.2mg/mL標準溶液。依次取0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL和10.0mL標準溶液用去離子水定容至10mL，搖勻備用。取200μL不同濃度的標準液加入1mL Folin-Ciocalteu（0.25M）試劑，劇烈振蕩搖勻后加入lmL 10%碳酸鈉溶液，震蕩搖勻后，加入2.8mL去離子水，室溫避光90min，吸取200μL待測液置于96孔板中，在765nm處測定吸光度。用去離子水作對照，以吸光度、濃度繪制標準曲線。待測樣品按照標準曲線的方式進行測定吸光值，通過標曲計算其濃度。

②多糖含量的測定

吸取葡萄糖標準溶液（0.1mg/mL）0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL置于試管中，各加蒸餾水至補足體積2mL，再加6%的苯酚溶液1mL，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸，搖勻后放置30min，吸取200μL待測液置于96孔板中，于490nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度與吸光度做標準曲線。待測樣品按上述方法進行多糖含量測定，根據(jù)標準曲線計算濃度。

2.結(jié)果分析

(1)NADES對多酚提取量的影響

由于低共熔溶劑具有兩親性，不僅對水溶性多糖有一定的提取效果，還可以提取一些包括多酚在內(nèi)的極性物質(zhì)，NADES對海茸多酚的提取如圖1所示。

圖1 海茸多酚的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of polyphenol from Durvillaea antarctica

通過圖1可知，作為對照組的乙醇對海茸多酚的提取效率為0.20mg/g，而9種NADES對海茸多酚的提取效率均顯著地高于乙醇（P＜0.05）。在所有的NADES中，NADES-6對多酚的提取率為2.29mg/g，是乙醇提取效果的10倍，且顯著地高于其他NADES的提取效果（P＜0.05）。由于NADES具有兩親性，可同時與多酚的極性基團和非極性基團具有相互作用力，因此難以簡單地將提取效率與NADES的極性相關(guān)聯(lián)。另外研究表明，相比于普通有機溶劑，NADES對植物細胞壁的破壞能力更強，這就導(dǎo)致更多的酚類物質(zhì)被釋放到提取液中，因此，NADES的提取效果要顯著地優(yōu)于乙醇的提取效果。

(2)NADES對多糖物質(zhì)提取的影響

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均稱為多糖，NADES對海茸多糖的提取率如圖2所示。

圖2 海茸多糖的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of Polysaccharide from Durvillaea antarctica

從圖2中可以看出，水對海茸多糖的提取量為126mg/g，9種NADES對海茸多糖的提取量均高于水的提取效果。其中NADES-6提取的多糖含量顯著地高于水提取多糖的量，多糖含量達到231mg/g，是水提取的1.83倍。NADE-7對多糖的提取效率為214mg/g，與NADES-6的差異不顯著。因此，兩者都可以顯著地提高海茸多糖的提取量。這可能是由于NADES具有較高的氫鍵結(jié)合能力以及可以與多糖發(fā)生靜電相互作用的原因引起的。

3.小結(jié)

采用超聲波輔助提取法，利用9種左旋肉堿作為氫鍵受體的NADES對海茸進行提取，由左旋肉堿和脯氨酸組合形成的NADES-6對多酚的提取率為2.29mg/g，是乙醇提取效果的10倍，且顯著地高于其他NADES的提取效果（P＜0.05）。此外，NADES-6提取的多糖含量達到231mg/g，是水提取的1.83倍。