舒芬太尼對大鼠骨折愈合的影響

李玉斐 馬智聰

舒芬太尼是芬太尼的衍生物，通過激動μ阿片受體發揮鎮痛作用，其鎮痛效果是芬太尼的5～10倍，且對呼吸和循環功能抑制較輕，可以降低應激反應因此被廣泛運用于骨科術中及術后鎮痛[1-3]。有研究證實舒芬太尼會抑制機體內P物質(SP)[5]、降鈣素相關基因肽(CGRP)[7]及c-fos基因[6,7]等的表達，發揮鎮痛作用，而這些基因和細胞因子在促進骨折愈合的過程中起到重要作用[5，8-13]。本實驗給予脛骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼處理，旨在研究舒芬太尼對大鼠骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 48只健康雄性SD大鼠，6周齡，體重(200±25) g,由山西醫科大學動物中心提供，所有SD大鼠分開飼養在相同鼠籠，每日攝食量相當，飲水不限，飼養溫度控制在22℃，12 h光照和12 h黑暗交替,飼養1周。枸櫞酸舒芬太尼注射液(廠家：人福醫藥，批號：11A05361)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠脛骨骨折模型的建立：SD大鼠經7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔內注射麻醉后，于右小腿脛骨中下1/3處使用骨折裝置制造橫形骨折。在右腿脛骨平臺處脫毛，碘伏消毒，切開皮膚后取適宜長度的0.8 mm克氏針從脛骨平臺穿入髓腔，手法復位后逆行穿入骨折遠端并固定，0.9%氯化鈉溶液沖洗后縫合切口。術后大鼠肌內注射青霉素8萬U/100 g，1次/d，連續肌內注射3 d，然后分籠飼養，死亡大鼠由備用同系大鼠在相同處理后補充。

1.2.2 實驗分組及用藥：將制備好脛骨骨折模型的48只SD大鼠隨機分為實驗組(腹腔注射舒芬太尼10 μg/kg,稀釋至0.5 ml)和對照組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.5 ml)2組,每組24只,術后第1天起開始給藥，每天早8∶00和晚20∶00給藥，每次給藥間隔12 h，2次/d。

1.2.3 實驗標本采集及觀察：術后第7天、14天、28天，分別從實驗組和對照組隨機選取8只大鼠，經水合氯醛腹腔注射麻醉后，頸動脈置管取血，將所取血液離心后取血清于-20℃冰箱保存。處死大鼠后取右下肢拍X線片觀察骨折愈合程度。然后取右脛骨，剔除干凈軟組織，用4%多聚甲醛固定24 h后使用EDTA脫鈣液脫鈣1個月，在脛骨骨痂遠近各1 cm處截取脛骨，脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟后，進行HE染色，顯微鏡下觀察大鼠骨折部位的骨組織學特征。

1.2.4 ELISA法檢驗大鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)和轉化生長因子β1(TGF-β1)水平。

1.2.5 免疫組化檢測骨形態發生蛋白2(BMP-2)表達水平，電子顯微鏡下進行圖像采集和分析。

2 結果

2.1 X線片比較

2.1.1 術后1周：實驗組骨折線清晰可見；對照組斷端稍模糊，出現輕度骨膜反應，但無骨痂生長。見圖1。

實驗組 對照組

2.1.2 術后2周：實驗組骨折線較清晰；對照組骨折線模糊，有少量骨痂形成。見圖2。

實驗組 對照組

2.1.3 術后4周：實驗組可見大量骨痂包繞斷端，但仍能看到骨折線；對照組骨折線完全消失，斷端可見大量外骨痂及少量骨橋連接骨折兩端。見圖3。

實驗組 對照組

2.2 HE染色組織學比較

2.2.1 術后1周：實驗組可見少量軟骨細胞與成骨細胞；對照組可見大量軟骨細胞形成和成骨細胞聚集現象，可見少量新生骨組織形成。見圖4。

實驗組 對照組

2.2.2 術后2周：實驗組可見大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁數量較少,排列紊亂；對照組可見較多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁寬度、數量多于實驗組。見圖5。

實驗組 對照組

2.2.3 術后4周:實驗組有較多成纖維細胞形成，但成熟骨小梁仍較少；對照組有大量成纖維細胞和骨小梁形成，骨小梁明顯增多、增厚，形成編織骨，并向成熟板層骨轉化。見圖6。

實驗組 對照組

2.3 血清ALP及TGF-β1含量比較 與對照組相比，實驗組大鼠血清堿ALP和TGF-β1含量在1周、2周、4周時均明顯降低(P<0.05。見表1、2。

表1 舒芬太尼對脛骨骨折大鼠血清堿性磷酸酶含量的影響

表2 舒芬太尼對脛骨骨折大鼠血清轉化生長因子β1含量的影響

2.4 骨折部位骨組織中BMP-2表達水平比較 與對照組相比，實驗組大鼠BMP-2表達水平在1周、2周、4周時均明顯降低(均P<0.05)。見表3，圖7。

表3 舒芬太尼對脛骨骨折大鼠骨折部位BMP表達水平的影響

實驗組 對照組 實驗組

3 討論

舒芬太尼是1974年合成,1976年被首次報道的芬太尼N2-4噻吩基衍生物，通過激動特異性μ阿片受體發揮鎮痛作用[2]。舒芬太尼鎮痛效價約為芬太尼5～10倍，是目前鎮痛效應最強的阿片類藥物，其脂溶性強，血漿蛋白結合率高，對呼吸系統、心血管系統及血流動力學抑制作用較芬太尼輕，被廣泛運用于骨科、心血管外科及產科等手術和術后鎮痛[3]。

舒芬太尼可以通過作用于人體大腦、腦干和脊髓等部位的阿片受體，抑制P物質(SP)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體、降鈣素基因相關肽(CGRP)及c-fos基因等的表達，發揮鎮痛作用。研究表明μ阿片受體激動劑可以通過使電壓門控Ca2+通道失活抑制NMDA受體誘導的P物質釋放[4]。P物質(SP)是一種神經遞質，通過傳遞疼痛信息，激活傷害性感受神經元，發揮致痛作用。P物質可以作用于骨髓基質細胞上的NK-1受體，促進成骨細胞的增殖、分化，從而促進骨形成[8]；也作用于骨髓巨噬細胞上的NK-1受體，促進破骨細胞生成，從而促進骨吸收[9]，通過促進骨形成和骨吸收，加速骨轉化，促進骨折愈合。王懿春等[5]實驗證實鞘內注射舒芬太尼可以抑制大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和降鈣素基因相關肽(CGRP)的表達。降鈣素基因相關肽作為疼痛因子參與多種慢性疼痛的形成，同時可以促進細胞內cAMP的產生，通過cAMP/PKA途徑增加骨髓基質細胞的礦化和堿性磷酸酶的活性，促進成骨細胞的增殖[10]。降鈣素基因相關肽(CGRP)還可以通過促進骨形態發生蛋白-2的表達，加速骨折愈合[11]。c-fos原癌基因屬于即刻早期基因(IECs)家族，很多研究表明傷害性刺激可以誘導c-fos基因的表達，c-fos基因的表達產物Fos蛋白可與Jun蛋白結合形成fos/jun異源二聚體AP-1，識別細胞表面的TRE位點，啟動TGF-β等因子的轉錄，進而促進骨折愈合[11，12]。而全身或局部應用阿片類藥物會抑制大腦皮質、海馬和脊髓c-fos基因的表達，且其抑制作用可以被阿片受體拮抗劑納洛酮逆轉[6,7]。

隨著社會發展和交通工具的變革，骨折患者的數量越來越多，在積極治療骨折的基礎上，緩解骨折患者的疼痛也越來越重要。目前臨床上常用的鎮痛藥物主要有非甾體抗炎藥和中樞性鎮痛藥，大量研究表明非甾體抗炎藥在鎮痛的同時會延緩骨折愈合[14，15]。許多實驗證實舒芬太尼會抑制骨折愈合相關的基因和細胞因子的表達，而關于中樞性鎮痛藥對骨折愈合的影響，筆者所見國內外鮮有報道，故本實驗對脛骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼處理，并與注射等量0.9%氯化鈉溶液的空白組大鼠進行對比，旨在研究舒芬太尼時候會抑制骨折愈合。X線片顯示術后1周時，實驗組大鼠骨折線清晰可見，對照組大鼠骨折斷端稍模糊，出現輕度骨膜反應，但無骨痂生長。術后2周時，實驗組大鼠骨折線較清晰，對照組大鼠骨折線模糊，有少量骨痂形成。術后4周時，實驗組大鼠可見大量骨痂包繞斷端，但仍能看到骨折線，對照組大鼠骨折線完全消失，骨折斷端可見大量外骨痂及少量骨橋連接骨折兩端。HE染色組織學結果顯示術后1周時，實驗組可見少量軟骨細胞與成骨細胞，對照組出現大量軟骨細胞形成和成骨細胞聚集現象，可見少量新生骨組織形成。術后2周時，實驗組可見大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁數量較少,排列紊亂，對照組可見較多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁寬度、數量多于實驗組。術后4 周時，實驗組有較多成纖維細胞形成，但成熟骨小梁仍較少，對照組有大量成纖維細胞和骨小梁形成，骨小梁明顯增多、增厚，形成編織骨，并向成熟板層骨轉化。

ALP可以分解有機磷酸化合物產生無機磷酸鹽離子，并與鈣離子結合成磷酸鈣沉淀于骨組織內，促進骨折愈合。堿性磷酸酶由成骨細胞分泌后可以滲入血液，使血清堿性磷酸酶含量增高，故血清堿性磷酸酶可以作為評價骨折愈合的指標[16]。本實驗中，實驗組和對照組血清堿性磷酸酶含量1周時開始上升，2周時含量最高，4周時逐漸降低，且在術后1周、2周、4周時，實驗組大鼠的血清堿性磷酸酶含量均低于對照組，結果有統計學意義。轉化生長因子1(TGF-β1)廣泛存在于正常細胞和轉化細胞中，以骨細胞和血小板中含量最多。TGF-β1存在于大鼠骨折愈合的各個階段，調控成骨細胞、破骨細胞、間充質細胞等多種骨細胞的增殖、分化，在骨折愈合過程中起到重要作用[17]。本實驗中，血清TGF-β1含量在術后1周、2周、4周不斷增高，且實驗組大鼠的血清TGF-β1含量均低于對照組，結果有統計學意義。BMP是TGF-β超家族中的一種酸性多肽，也是目前最強的成骨因子，其中BMP-2是BMP中研究最多的亞型，也是成骨作用最強的亞型,可誘導間充質細胞向成骨細胞轉化，促進骨折愈合[18]。 本實驗中，在術后1周、2周、4周時，實驗組大鼠的骨組織骨形態發生蛋白2表達水平均低于對照組，結果有統計學意義。

綜上所述，舒芬太尼處理的脛骨骨折大鼠在影像學和組織形態學上骨折愈合程度低于單純脛骨骨折大鼠，且同一時間段，舒芬太尼處理的脛骨骨折大鼠血清ALP含量、血清TGF-β1含量及骨組織BMP-2表達水平低于單純脛骨骨折大鼠。故本實驗證實舒芬太尼會抑制脛骨骨折大鼠的骨折愈合，應慎用于骨折患者的鎮痛治療，尤其是老年人、骨質疏松患者等易發生骨折延遲愈合或骨折不愈合的患者。舒芬太尼對骨折愈合的抑制作用可能是通過抑制P物質、降鈣素基因相關肽及c-fos基因等的表達來實現的，關于舒芬太尼抑制骨折愈合的具體機制有待進一步研究。