紅花黃色素聯合二甲雙胍對早期糖尿病腎病患者腎臟纖維化、尿足細胞損傷的影響

鮑喜靜 李建英 彭一 董陸玲 張貴山 楊秀紅 王新婷 辛麗娟 張翠靜 吳嘉鳴

糖尿病腎病(diabetic nephrology，DN)主要病理變化是腎小球硬化、腎小管-間質纖維化，患者表現為腎功能降低及蛋白尿，嚴重者逐漸發展至腎功能衰竭，預后較差[1-3]。因此，在DN早期采取積極干預手段逆轉或延緩疾病進展是改善預后的關鍵。本研究探討了紅花黃色素聯合二甲雙胍對早期DN患者腎臟纖維化、尿足細胞損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2015年10月至2016年10月80例DN患者的臨床資料，隨機分為對照組和觀察組，每組40例。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=40

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合2型糖尿病、早期DN診斷標準；②患病時間至少1年；③患者均知情同意。

1.2.2 排除標準：①重要臟器功能障礙；②其他原因(高血壓、尿路結石等)引起的尿蛋白排泄率增加；③惡性腫瘤患者；④對研究藥物過敏者。

1.3 治療方法 2組均給予常規治療，包括健康宣教、飲食指導、運動鍛煉等。

1.3.1 對照組：給予鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370)，2 g/d，口服。

1.3.2 觀察組：給予鹽酸二甲雙胍片的同時靜脈滴注紅花黃色素(浙江永寧藥業股份有限公司，批號 220050146)，100 mg紅花黃色素+250 ml 0.9%氯化鈉溶液，1次/d。連續治療14 d。

1.4 檢測方法

1.4.1 標本采集：采集患者空腹肘靜脈血5 ml，離心，取上清，存于-20℃冰箱。另留取治療前后患者中段尿20 ml，500 r/min離心10 min，棄上清。

1.4.2 腎臟纖維化指標：采用放射免疫法測定血清層粘連蛋白(LN)、透明質酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.3 轉化生長因子β1(TGF-β1)、Smad：采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定血清TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.4 足細胞損傷標志物：采用ELISA測定尿液中Podocin、Nephrin、ZO-1水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.5 足細胞影響因子：采用ELISA測定尿液中結締組織生長因子(CTGF)、骨橋蛋白(OPN)、骨形態發生蛋白(BMP-7)水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.6 足細胞數：在熒光顯微鏡下觀察尿沉渣中呈綠色熒光的圓形或橢圓形細胞，選取不同部位20個視野，計數足細胞數，取均值。

2 結果

2.1 2組腎臟纖維化指標比較 2組治療前LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平明顯低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平均顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組腎臟纖維化指標比較

2.2 2組TGF-β1、Smad水平比較 2組治療前TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平明顯低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 2組TGF-β1、Smad水平比較

2.3 2組足細胞損傷標志物比較 2組治療前Podocin、Nephrin、ZO-1水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后Podocin、Nephrin、ZO-1水平明顯低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后Podocin、Nephrin、ZO-1水平低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組足細胞損傷標志物比較

2.4 2組足細胞影響因子比較 2組治療前CTGF、OPN、BMP-7水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后CTGF、OPN、BMP-7水平明顯低于治療前，BMP-7水平明顯高于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后CTGF、OPN、BMP-7水平低于對照組，BMP-7水平高于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 2組足細胞影響因子比較

2.5 2組足細胞數比較 2組治療前足細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后足細胞數明顯低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后足細胞數低于對照組(P<0.05)。見表6。

表6 2組足細胞數比較 n=40,個

3 討論

糖尿病患者機體長期處于糖脂代謝異常狀態，該狀態可引起全身各器官損害，其中DN是最常見的糖尿病微血管并發癥，容易導致腎小球硬化、基底膜增厚及系膜細胞基質積聚，這是造成腎功能減退及尿蛋白量增加的重要病理機制[4,5]。LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C是評估腎臟纖維化的常用指標，DN患者血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平通常表現為異常增高，檢測其水平能夠在一定程度上反映腎臟纖維化進程及疾病治療效果。本研究結果顯示，2組治療前LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平明顯低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C水平低于對照組(P<0.05)，表明紅花黃色素聯合二甲雙胍能夠抑制腎臟纖維化進程，從而改善腎功能。

研究證實，TGF-β1/Smad信號通路在DN發生發展中發揮關鍵作用[6,7]。TGF-β1具有調控細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學功能，此外TGF-β1在促進慢性腎臟纖維化和系膜細胞基質積聚中發揮重要作用。TGF-β1與TGF-βⅠ型受體結合形成受體復合物，通過磷酸化效應激活其受體底物Smad蛋白，后者轉移至細胞核中可調控相關轉錄因子的表達，促進Ⅰ型膠原分泌及腎小管上皮-間質轉化(EMT)進程，最終導致腎臟纖維化形成[8,9]。

大量研究表明，DN患者和腎臟損傷模型動物血清中TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白表達上調，而采用基因敲除、抑制劑或miRNA抑制TGF-β1/Smad信號通路活化能夠改善腎臟纖維化[10,11]。本研究結果表明，2組治療前TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平明顯低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后TGF-β1、Smad1、Smad2、Smad3水平低于對照組(P<0.05)，提示紅花黃色素聯合二甲雙胍可能通過調控TGF-β1/Smad信號通路發揮腎臟保護作用。

此外，TGF-β1/Smad信號通路參與誘發腎臟局部氧化應激反應和氧自由基大量生成，從而引起尿足細胞結構蛋白的表達和分布發生改變，導致其與腎小球基底膜間黏附性降低，進而脫落隨尿液排出。因此，DN患者尿足細胞損傷是腎臟濾過膜通透性增加及蛋白尿產生的本質原因之一[12,13]。在此過程中大量足細胞標志分子隨之進入尿液，其中Podocin、Nephrin、ZO-1是反映尿足細胞氧化應激損傷程度的指標，共同參與裂孔膜復合體的形成，從而維持腎小球基底膜完整性[14,15]。此外，CTGF具有促進成纖維細胞增殖、細胞外基質積聚等作用，在腎小球硬化、腎小管纖維化形成中發揮重要作用；OPN通過調控免疫炎性反應促進尿足細胞脫落；BMP-7能夠抑制炎性反應，從而減輕尿足細胞脫落[16,17]。

本研究結果顯示，2組治療前Podocin、Nephrin、ZO-1、CTGF、OPN、BMP-7水平及足細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；2組治療后Podocin、Nephrin、ZO-1、CTGF、OPN水平及足細胞數明顯低于治療前，BMP-7水平明顯高于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，且觀察組治療后Podocin、Nephrin、ZO-1、CTGF、OPN、BMP-7水平及足細胞數低于對照組，BMP-7水平高于對照組(P<0.05)，表明紅花黃色素聯合二甲雙胍能夠減輕腎臟足細胞損害，從而改善DN患者病情。

綜上所述，紅花黃色素聯合二甲雙胍可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路改善早期DN患者腎纖維化，并減輕尿足細胞損傷，效果優于單純二甲雙胍治療。TGF-β1/Smad信號通路可能成為治療早期DN的潛在靶點。