細胞焦亡在狼瘡性腎炎發病機制中的研究進展

王 晨 林 栩

系統性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)是一種復雜自身免疫性疾病，累及全身多器官系統，有多種免疫細胞如T淋巴細胞和B淋巴細胞的參與，以多種抗體以及免疫復合物的形成、補體激活為特征。狼瘡性腎炎 (lupus nephritis, LN)是SLE患者的常見并發癥。臨床上以免疫抑制劑合并糖皮質激素為主要治療手段，雖然病死率及腎臟存活率有所改善，還是有10%～30%的狼瘡性腎炎發展為腎衰竭，需要腎臟替代治療[1,2]。因而早期診斷及規范化治療對提高狼瘡病人生活質量以及改善預后有及其重要的意義。隨著學術界對細胞程序性死亡的深入了解，目前已有研究表明，細胞焦亡這種新型細胞死亡方式與狼瘡性腎炎的疾病進展密切相關。本文就細胞焦亡參與狼瘡性腎炎疾病發生、發展機制的研究進展及未來應用前景展開討論。

一、細胞焦亡

焦亡屬于細胞程序性死亡(progammed cell death,PCD)的一種，是混合壞死和凋亡特征的一種非典型細胞死亡方式，在促進人的生長發育以及維持內環境穩態方面具有重要意義[3]。在1992年，Zychlinsky等發現了福氏志賀菌感染的巨噬細胞發生了細胞死亡，該型細胞死亡有細胞凋亡的特征：染色質固縮及DNA片段化，當時認定這種細胞死亡方式為細胞凋亡；無獨有偶，Hilbi前后在1997年及1998年，在觀察福氏志賀菌誘導巨噬細胞凋亡的過程中發現了激活的含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1)表達，且證明該種死亡方式不依賴于caspase-3，而是依賴于caspase-1[4，5]；1999年，Hersh等通過敲除巨噬細胞caspase-1阻斷巨噬細胞死亡，證明caspase-1可能是此種細胞死亡方式的關鍵蛋白[6]。此后Brennan在2000年通過沙門菌誘導巨噬細胞死亡實驗中也同樣發現了該死亡方式與caspase-1密切相關，明確提出該種細胞死亡方式不同于細胞凋亡，可以破壞細胞膜，不伴有凋亡相關caspase-3及PARP的活化，且有明顯的DNA片段化[7]。2001年Cookson和Brennan等正式以細胞焦亡來命名這種死亡方式[8]。至此關于細胞焦亡的研究開始飛速發展。2015年Gasdermin D作為焦亡關鍵效應蛋白被報道，焦亡的下游作用機制逐步完善[9]。隨著對細胞死亡方式的研究以及對相關機制的了解，2018年細胞死亡命名委員會(Nomenclature Committee on Cell Death,NCCD)定義細胞焦亡為依賴Gasdermin蛋白家族成員形成的質膜孔隙的一種細胞死亡方式，與炎性caspase的激活與否沒有必然聯系，至此學術界對于細胞焦亡的定義日趨完善[10]。

細胞焦亡、細胞凋亡及細胞壞死三者同屬PCD，彼此之間在生化和形態學特征雖有相似也各有不同，簡言之胞核固縮或斷裂，胞膜完整，有凋亡小體形成，為凋亡(apoptosis)細胞形態特征；胞核固縮或斷裂，胞質腫脹，胞膜不完整，且有炎性小體的形成，為焦亡(pyroptosis)細胞形態特征；胞核腫脹或溶解，胞質腫脹，胞膜不完整，且有壞死小體的形成，為壞死(necrosis)細胞形態特征。細胞凋亡是一種由基因調控由凋亡小體介導的非炎性細胞程序性死亡方式。細胞壞死和焦亡可引起強烈的細胞炎癥，質膜的完整與否是區別細胞凋亡與細胞壞死和焦亡的標志，細胞壞死中細胞膜通道成孔是由混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介導的，而細胞焦亡則依賴于Gasdermin蛋白家族的非選擇性打孔特性[11，12]。根據不同細胞死亡過程中細胞膜通透性的變化，可以通過Yo-PRO-1和Eth D-2雙染證實是否發生焦亡現象[13～16]。Yo-PRO-1是一種細胞膜封閉的陽離子，在凋亡早期細胞膜通透性輕微增加，此時Yo-PRO-1可以進入細胞與DNA結合形成綠色熒光，Eth D-2相對分子質量則較大不能通過焦亡的細胞膜孔進入，而在壞死細胞中可呈現陽性，且有不能與其他染料共存的特性，詳見表1。

表1 細胞凋亡、焦亡及壞死的比較

二、細胞焦亡關鍵蛋白

焦亡主要發生機制為NOD樣受體(NLRs)或Toll樣受體(TLRs)通過識別胞內或胞外的刺激因子，從而促進炎性小體的組裝，炎性小體(inflammasome)由3個主要部分構成，細胞質傳感器NLR蛋白 (NOD-containing protein-like receptors)、銜接蛋白凋亡相關斑點蛋白ASC (apoptotic-associated speck-like protein containing CARD) 和炎性半胱天冬氨酸蛋白酶-1前體蛋白(pro-caspase-1)。ASC作為接頭蛋白負責NLR蛋白及pro-caspase-1的連接。又根據炎性小體的組成受體不同，分為NLRP1炎性小體、NLRP3炎性小體、AIM2炎性小體、IPAF炎性小體。其中NLRP1炎性小體及IPAF炎性小體可以不依賴于接頭蛋白ASC可以直接與pro-caspase-1連接[17]。炎性小體在細胞焦亡中起承上啟下的關鍵作用，炎性小體是一類可以在胞內識別病原體相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)信號的受體。通過識別上游刺激，募集并活化caspase-1，活性caspase-1切割下游關鍵蛋白GSDMD，形成有細胞毒性的GSDMD-N端，激活下游炎性細胞因子IL-1β、IL-18。最終導致細胞焦亡。活化的caspase切割 GSDMD-N端及GSDMD-C端之間的柔性連接蛋白從而解除C端的自身抑制效應，以此激活Gasdermin。Gasdermin蛋白作為一種打孔蛋白可以在細胞膜上形成功能性孔隙，導致細胞腫脹破裂，胞內炎性物質釋放激活并放大炎性反應。以下就caspase家族及Gasdermin家族在細胞焦亡這一過程中的作用機制作簡略闡述。

caspase家族首先是作為細胞凋亡的關鍵蛋白而被人們熟知，隨著研究的不斷深入，caspase家族的其他功能也被漸漸發掘。目前已知caspase家族有16個成員，序列及結構高度相似，主要以N端前域結構的不同而鑒別，通常以無活性的酶原形式存在。這其中以caspase-1研究歷史最為久遠，參與多種疾病的發生、發展。caspase-1最早是作為白細胞介素(IL)-1β轉換酶(ICE)被發現，且與1993年發現的線蟲凋亡相關的蛋白CED-3具有同源性。

目前認為細胞焦亡主要是由caspase-1/4/5/11介導的一種細胞程序性死亡。根據caspase的不同區分焦亡的經典與非經典途徑。依賴于caspase-1的細胞死亡方式稱為經典焦亡途徑，在內源性或者外源性危險信號刺激下，炎性小體組裝活化，炎性小體活化后將pro-caspase-1 激活為活化的 caspase-1，并介導促進白細胞介素 -1β 和 IL-18 等炎性細胞物質的成熟及釋放，從而招募更多的炎性細胞一步放大炎性反應。依賴人源caspase-4/5和鼠源的caspase-11的細胞死亡方式稱為非經典焦亡途徑，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)不依賴與TLR4 可以直接通過與CARD域(caspase募集結構域)結合激活caspase-4/5/11[9,18,19]。活化后的 caspase-4/5/11同樣可以通過切割下游GSDMD，使后者C端結構域與N端結構域分離，暴露N端結構域，解除GSDMD的自身抑制作用。2015年有研究者發現縫隙連接蛋白1(pannexin-1,Panx-1)及膜通道嘌呤能受體蛋白P2X7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7)在非經典途徑中發揮不可或缺的作用[20]。也有研究發現caspase-3可以通過切割GSDME并引發焦亡。

Gasdermins家族是一類在細胞焦亡的下游通路發揮活性的具有打孔功能的蛋白家族。包括括Gasdermin-A(GSDMA)、Gasdermin-B(GSDMB)、Gasdermin-C(GSDMC)、Gasdermin-D(GSDMD)、Gasdermin-E(GSDME/DFNA5)和 Pejvakin(PJVK/DFNB59)。其中GSDMD及GSDME在細胞焦亡中發揮主要作用，GSDMD的N端具有細胞毒性，C端與N端在靜息狀態下結合抑制不發揮毒性作用。當caspase活化后，可激活GSDMD解除自身抑制。該N端結構域具有在膜上打孔的作用，可導致細胞膜孔洞形成，細胞不斷膨脹直至破裂，細胞內容物 IL-1β和IL-18等釋放，從而激活并放大炎性反應，引發細胞焦亡[21]。

三、細胞焦亡在LN的炎性進展中發揮重要作用

無菌性炎性反應是許多臨床腎臟疾病的特征，SLE及LN中炎癥機制的失調，可以促進LN的器官損害，已有研究表明細胞焦亡在SLE和LN疾病發展過程中起重要作用，細胞焦亡可能成為系統性紅斑狼瘡的一種重要發病機制[22]。研究證實，NLRP3炎癥體的激活以及其介導下游caspase -1依賴的細胞因子IL-1β和IL-18的釋放，導致Gasdermin D介導的致死性細胞焦亡[23]。在LN患者和狼瘡易感小鼠的足細胞中NLRP3炎性小體及caspase-1的活性片段p20被激活，且抑制NLRP3的激活可以減少狼瘡性腎炎IL-1β、caspase-1的表達、足細胞損傷和蛋白尿的產生[24]。

2011年Kahlenberg等在狼瘡性腎炎活檢組織中檢測到NLRP3、caspase-1和血清IL-18表達的增加[25]。提示這一組織為炎性小體的激活及細胞焦亡的發生做準備。2013年該課題組又發現SLE患者中發現中性粒細胞胞外殺傷網格(neutrophil extracellular traps, NETs)增多，可激活巨噬細胞中的NLRP3小體，促進caspase-1的活化及IL-1β和IL-18的釋放，誘導細胞焦亡的產生，IL-18能夠再次誘發NETs，循環加重SLE的發展及器官損害[26]。2014年Kahlenberg等[27]通過進一步構建狼瘡小鼠模型，發現缺乏炎性小體中樞caspase-1 的小鼠不表現出SLE和LN的癥狀。在LN中，Pim-1可以激活NLRP3炎性小體導致焦亡通路的進一步活化，而在沉默Pim-1基因的足細胞中NLRP3、caspase-1、p20及IL-1β的活性則明顯降低，這同樣提示了細胞焦亡通路激活在SLE及LN發病機制中的重要作用[28]。也有研究者提出在LN中不僅有焦亡通路活性的增強，焦亡細胞的清除障礙可能會導致狼瘡患者長期暴露自身抗原從而破壞免疫耐受進一步推動SLE的發病[29，30]。但這一觀點還需要更多臨床研究數據證實。

四、展 望

細胞焦亡發現以來，研究者通過對細胞焦亡的定義、打破、再定義、再打破。隨著對細胞焦亡的了解不斷深入，作用機制也逐漸明朗。大量研究表明細胞焦亡在許多腫瘤免疫及心血管疾病發病機制中發揮了重要作用。學術界關于狼瘡與焦亡的研究空間很大，其中抑制細胞焦亡的過度激活并加速焦亡細胞的清除有可能是一種有力的狼瘡治療措施。未來的研究可以針對caspase的激活機制及與 GSDMD的直接作用關系，實現精準用藥，使導入體內的細胞焦亡關鍵蛋白caspase-1及GSDMD等抑制劑直接作用于狼瘡關鍵靶點。