利用Cre-loxP系統構建AT2細胞特異性敲除HDAC3基因小鼠

熊 銳 李國瑞 鄒詩施 李 寧 耿 慶

組蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)是組蛋白去乙酰化酶家族的一員，具有調節生物節律、代謝和發育的功能，位于細胞核中，在特定條件下可以從細胞核轉位到胞質中發揮作用[1]。筆者團隊前期研究顯示，HDAC3參與了多種疾病的病理過程，包括缺血再灌注損傷、纖維化、神經退行性變、感染和炎癥[2]。特別是在肺損傷中，HDAC3在促進炎性細胞因子的表達中起著多方面的作用，這是由HDAC3的酶活性決定的，因此在基因層面抑制HDAC3的表達或者在藥理學層面抑制其酶活性可能是減輕肺損傷的重要策略[3,4]。

肺泡2型上皮(alveolar type 2 epithelial，AT2)細胞在產生肺表面活性物質方面具有獨特的功能，并在肺損傷中作為祖細胞發揮作用[5,6]。此外，AT2細胞的損傷與肺纖維化和炎癥有關[7，8]，而HDAC3作為肺穩態重要的調節酶，在AT2細胞中如何發揮生物學功能鮮見報道。因此，筆者聚焦于AT2細胞來探討HDAC3在肺部疾病中的作用及機制。

本研究利用Cre-loxP系統，選取HDAC3flox/-小鼠與AT2細胞特異性表達Sftpc-Cre重組酶的工具鼠進行數代雜交，成功構建了AT2細胞特異性敲除HDAC3的基因小鼠，為探究肺部疾病的發病機制及治療靶點提供了動物研究模型。

材料與方法

1.實驗動物：HDAC3-flox(+/-)小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，交付2雌1雄，6～8周齡，體質量為20～25g。Sftpc-Cre(+/-)小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，交付2雄1雌，6～8周齡，體質量為20～25g。所有動物均飼養于武漢大學人民醫院動物實驗中心SPF 級動物間(25℃，光暗周期12h/12h),實驗操作均獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會批準[WDRM動(福)第20210305號]。

2.主要試劑：動物基因組DNA快速抽提試劑盒及Taq Master Mix購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；基因鼠所用鑒定引物分別由上海南方模式生物科技股份有限公司和江蘇集萃藥康生物科技有限公司設計，北京擎科生物科技有限公司負責合成，鑒定HDAC3-flox小鼠所需引物序列為P1上游引物: 5′-GACACCTCTGTGATGAGCCA-3′，P2下游引物:5′-CCCCTCTTGTCACTTTCCCC-3′。鑒定Sftpc-Cre小鼠所需引物序列為:①3′arm上游引物:5′-TGTGAGGAAACTGATCCTCGAG-3′, 下游引物: 5′-AGGCCACCTCTTCCCGTCCCGT-3′;②WT上游引物:5′-TGCTTCACAGGGTCGGTAGAAAC-3′, 下游引物: 5′-TAACACCCGTGTATGGCACCC-3′。TNF-α檢測試劑盒(H052-1)購自南京建成生物工程研究所。ABCA3抗體(A6862)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司, HDAC3抗體(BF0230)購自江蘇親科生物研究中心有限公司, CY3標記山羊抗兔(SA00009-2)，CY3標記山羊抗小鼠(SA00009-1), CoraLite488標記山羊抗兔(SA00013-2)和CoraLite488標記山羊抗小鼠(SA00013-1)均購自武漢三鷹生物技術有限公司。DAPI染液(G1012)，HE染液(G1005),SerRed核酸染料10000(G3606)，DNA marker(G3361、G3367)等其他試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

3.AT2胞HDAC3基因條件性小鼠模型的建立：(1)將Sftpc-Cre(+/-)小鼠自交獲得雜合Sftpc-Cre(+/-)小鼠。(2)將HDAC3flox/-小鼠自交獲得HDAC3flox/flox小鼠和HDAC3flox/-小鼠。(3)將Sftpc-Cre(+/-)小鼠與HDAC3flox/flox小鼠或HDAC3flox/-小鼠雜交，得到雙雜合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre(+/-)。(4)將獲得的雙雜合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre(+/-)與HDAC3flox/flox小鼠或HDAC3flox/-小鼠雜交，獲得目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre(+/-)。

4.小鼠基因組DNA提取及擴增：取1周齡左右小鼠，剪取鼠尾約5mm，使用動物基因組DNA快速抽提試劑盒提取小鼠基因組DNA：首先加入400μl Buffer Digestion和40μl蛋白酶K溶液，置于65℃水浴裂解3h；裂解完成后，加200μl Buffer PA，充分顛倒混勻置于-20℃放置5min，室溫10000r/min離心5min并轉移上清；接下來加入等體積異丙醇，充分混勻后室溫放置2～3min，室溫10000r/min離心5min，棄上清后用75%乙醇清洗兩遍，開蓋室溫倒置5～10min至乙醇完全揮發；最后將得到的基因組DNA用50μl TE Buffer溶解，溶解液即為基因組DNA。將提取的基因組DNA測定濃度后用PCR擴增目的基因，PCR反應體系25μl為：2×San Taq PCR Mix 12.5μl，DNA模板1μl，上游引物(10μmol/L) 1μl，下游引物(10μmol/L) 1μl，Sterilized ddH2O 9.5μl。PCR反應程序為：①95℃，5min；②98℃，30s；③65℃ (-0.5攝氏度/循環)，30s；④72℃，45s；②③④20個循環；⑤98℃，30s，⑥55℃，30s；⑦72℃，45s；⑤⑥⑦20個循環；⑧72℃，5min；⑨10℃，維持。對HDAC3-flox小鼠的鑒定只需進行一組PCR反應；對Sftpc-Cre小鼠的鑒定需進行兩組PCR反應，分別為WT反應組和3′arm反應組。

5.擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳：將5×的TAE用超純水稀釋成1×的TAE，配制2%瓊脂糖凝膠，煮沸充分混勻后以1∶10000加入SerRed核酸染料，再次混勻后倒入制膠器中并插入梳子進行凝膠制作。約30min后，拔出梳子。將凝膠置于電泳槽中，每個梳孔上樣10μl擴增產物后開始電泳，恒壓160V，約30min可結束電泳。取出凝膠，于BioRad成像儀下進行DNA成像。

6.基因型鑒定結果的判讀：根據上海南方模式生物科技股份有限公司和江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司提供的鑒定方案進行結果判讀。對于HDAC3-flox小鼠，HDAC3flox/flox小鼠可見356bp一條條帶，HDAC3flox/-小鼠可見290bp 和356bp 兩條條帶, 野生型可見290bp一條條帶。對于Sftpc-Cre小鼠，Sftpc-Cre(+/+) 小鼠在WT反應組無條帶，在3′arm反應組可見838bp一條條帶；Sftpc-Cre (+/-)小鼠在WT反應組可見386bp一條條帶，在3′arm反應組可見838bp一條條帶；野生型在WT反應組可見386bp一條條帶，在3′arm反應組無條帶。

7.免疫熒光驗證敲除效果：小鼠斷頸處死后，取出肺組織，4%多聚甲醛固定24h以上，再將肺組織按程序經乙醇、二甲苯和石蠟之后，進行脫水浸蠟、包埋，蠟塊凝固后取出備用。在切片機上，將蠟塊切片成2～3μm厚。切片脫蠟至水，依次放入二甲苯115min，二甲苯215min，無水乙醇15min，無水乙醇25min，90%乙醇5min，75%乙醇5min，自來水洗。微波爐加熱進行抗原修復后冷卻至室溫，PBS洗3次，每次5min。切片滴加適量一抗工作液(ABCA3-1∶150, HDAC3-1∶150)，4℃過夜。次日復溫，PBS洗3次，每次5min。再滴加適量二抗工作液(CY3標記山羊抗兔-1∶100， CoraLite488標記山羊抗小鼠1∶100)，37℃水浴鍋,避光孵育40min，PBS洗3次，每次5min。滴加DAPI染核，室溫避光孵育20～30min，PBS洗。用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下測量HDAC3在ABCA3陽性細胞即AT2細胞中熒光強度。每只小鼠肺組織切片在400倍鏡下隨機選取3個視野進行測量，總熒光強度值與ABCA3陽性細胞數的比值作為該小鼠AT2細胞中HDAC3的相對表達量。

8.蘇木精-伊紅(HE)染色觀察兩組小鼠各組織形態：小鼠斷頸處死后，取出肺組織，4%多聚甲醛固定24h以上，再將肺組織按程序經乙醇、二甲苯和石蠟之后，進行脫水浸蠟、包埋，蠟塊凝固后取出備用。在切片機上，將蠟塊切片成2～3μm厚。切片依次經二甲苯110min，二甲苯210min，無水乙醇15min，無水乙醇25min，90%乙醇5min，75%乙醇5min，自來水洗。處理好后，蘇木精染液染色3～5min，自來水洗；再經蘇木精分化液2～5s，自來水洗；蘇木精返藍液2～5s，自來水流水充分沖洗；切片依次經85%、95%梯度乙醇脫水，各5min。然后進入伊紅染液(醇溶)中染色5min，經兩次無水乙醇脫水各5min；切片再經新鮮無水乙醇脫水5min，二甲苯透明5min，更換新鮮的二甲苯再透明5min；最后，滴加中性樹膠進行封片，顯微鏡下拍照。

9.小鼠肺勻漿中TNF-α含量以及心臟、肝臟和腎臟功能的測定：經小鼠尾靜脈抽取靜脈血0.5ml，4℃，3500r/min，離心5min，取上清液通過全自動生化儀檢測血清肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肌酐(creatinine)。斷頸法處死小鼠，取新鮮肺組織制成勻漿，4℃，5000r/min，離心10min，取上清液根據腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的Elisa檢測試劑盒說明書按步驟進行測定。

結 果

1.HDAC3-flox小鼠基因型鑒定結果：引進的HDAC3-flox雜合子小鼠雌雄合籠繁殖出3 種基因型子代小鼠，基因型鑒定結果，詳見圖1。PCR電泳實驗結果顯示純合子HDAC3flox/flox小鼠可見356bp一條條帶，HDAC3flox/-雜合子小鼠可見290bp和356bp 兩條條帶，野生型可見290bp一條條帶。

圖1 HDAC3-flox小鼠基因型鑒定655、660.WT反應組；697、698.HDAC3flox/-；656、657、658.HDAC3flox/flox

2.Sftpc-Cre小鼠基因型鑒定結果：引進的Sftpc-Cre雜合子小鼠雌雄合籠繁殖出兩種基因型子代小鼠，基因型鑒定結果詳見圖2。PCR電泳實驗結果顯示純合子Sftpc-Cre(+/+) 小鼠在WT反應組無條帶，在3′arm反應組可見一條838bp條帶。Sftpc-Cre (+/-) 雜合子小鼠在WT反應組可見一條386bp條帶，在3′arm反應組可見一條838bp條帶。

圖2 Sftpc-Cre小鼠的基因型鑒定A.WT反應組；B.3′arm反應組。14、15.Sftpc-Cre (+/-)；16、17.Sftpc-Cre(+/+)

3.雙雜合基因小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre (+/-)的鑒定結果：將子代Sftpc-Cre (+/-)小鼠與子代HDAC3flox/-小鼠或者HDAC3flox/flox進行雜交，以獲取雙雜合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre (+/-)，此步尤為關鍵。綜合PCR電泳實驗結果詳見圖3，816、818、819和820為雙雜合小鼠，817為Sftpc-Cre (+/-)小鼠。

圖3 HDAC3flox/-Sftpc-Cre (+/-)小鼠基因型鑒定A.816、818、819、820: HDAC3flox/-，817：WT; B. 816、817、818、819、820: Sftpc-Cre (+/-)

4.AT2細胞敲除HDAC3基因小鼠的鑒定結果：將獲得的雙雜合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre(+/-)與HDAC3flox/flox小鼠或HDAC3flox/-小鼠雜交，以獲取目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)，綜合PCR電泳實驗結果詳見圖4，29、32、33和35均為目的小鼠。

圖4 HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)小鼠基因型鑒定A.29、32、33、35:HDAC3flox/flox，27、28、30、31、34：HDAC3flox/-；B. 29、32、33、35：Sftpc-Cre (+/-)，27、28、30、31、34：Sftpc-Cre (+/+)

5.HDAC3在小鼠肺AT2細胞中敲除效果：免疫熒光結果顯示，HDAC3在HDAC3flox/flox小鼠肺中有表達，且和ABCA3存在共定位，說明正常生理條件下AT2細胞中存在HDAC3表達。在獲得的目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)中，可見HDAC3在小鼠肺中表達顯著降低，未見明顯HDAC3和ABCA3共定位(P<0.001,圖5)。這些都說明HDAC3在AT2細胞中幾乎全被敲除，敲除效果滿意。

圖5 免疫熒光染色驗證HDAC3 在小鼠AT2細胞敲除效果(×400)A.兩組小鼠肺組織石蠟切片免疫熒光結果示ABCA3和HDAC3共定位情況(n=3),紅光指示ABCA3，綠光指示HDAAC3，Merge為紅光和綠光融合；B.對免疫熒光結果的定量分析顯示與HDAC3flox/flox小鼠比較，HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)小鼠肺組織HDAC3在AT2細胞中的相對表達量明顯減少

6.小鼠各臟器組織形態學與功能研究：為了證明筆者構建的小鼠安全、可靠，生理情況下不會因為基因的敲除導致小鼠全身臟器受損甚至死亡，筆者通過HE染色觀察了目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)和對照組小鼠HDAC3flox/flox的心臟、肝臟、肺和腎臟的組織形態。結果表明(圖6A), 兩組小鼠的各臟器未出現明顯的病變和差異。心肌纖維排列整齊，形態完整清晰；肝細胞排列規則，核圓居中，胞質均勻；肺組織無充血水腫，無炎性細胞浸潤，肺泡間隔均勻；腎臟結構清晰，腎小球和腎小囊大小正常，無出血。此外，兩組小鼠分別反映心臟、肝臟、肺和腎臟組織損傷水平的CK-MB、ALT、肌酐和肺勻漿中TNF-α差異均無統計學意義(圖6中B～E)。

圖6 兩組小鼠心臟、肝臟、肺和腎臟組織形態與功能學A. HE染色顯示兩組小鼠(n=3)心臟、肝臟、肺和腎臟組織均未出現明顯損傷，組織結構清晰，細胞形態正常，排列規律，無炎性細胞浸潤，無充血水腫(×100)；B～E. 兩組小鼠(n=3)反映心臟、肝臟、肺和腎臟組織損傷水平的CK-MB、ALT、TNF-α和肌酐差異均無統計學意義

討 論

許多基因在不同的細胞類型中扮演不同的角色，因此，需要將這些基因在特定組織或細胞中進行編輯 (稱為條件性基因表達)來充分了解它們的功能。Cre-loxP是一種條件性基因敲除系統，已經被廣泛用于小鼠特定組織或細胞的基因敲除，通過在目的基因兩端內含子插入loxP序列，運用不同的Cre重組酶工具鼠進行打靶，能夠將目的基因在小鼠不同組織或細胞中進行敲除[9]。既往研究中，已經有研究者利用Cre-loxP系統成功構建出肝組織特異性ATF5敲除小鼠模型，乳腺細胞特異性敲除SENP7基因小鼠模型，血管內皮細胞敲除DEPTOR基因小鼠模型等，各自為目的基因在特定組織中的生物學功能研究提供了在體模型，說明該系統比較成熟，技術上可行，便于研究[10～12]。本研究選用Sftpc-Cre工具鼠成功對小鼠AT2細胞中HDAC3基因進行打靶。ABCA3是在AT2細胞中高表達的跨膜蛋白，所以筆者將HDAC3和ABCA3進行免疫熒光共定位以驗證敲除效果[13,14]。在對照組小鼠HDAC3flox/flox中，HDAC3在AT2細胞中可見正常表達，而在目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre(+/-)中，HDAC3在AT2細胞中幾乎不表達，敲除效果滿意。此外，為了提供一個安全、可靠的實驗動物模型，筆者還對小鼠的心臟、肺、肝臟和腎臟的組織形態學進行了研究，證明了在生理情況下，AT2細胞中敲除HDAC3對小鼠各臟器無明顯損害。

AT2細胞作為呼吸屏障的重要組成部分，具有調節肺部免疫系統，保護肺部免受損傷的功能[15]。研究表明，AT2細胞在特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)發病機制中起著核心作用，因為AT2細胞的功能障礙和反復的細胞損傷是IPF發病的直接原因[16]。筆者前期綜述了HDAC3在多種實質性器官損傷特別是肺損傷中發揮重要作用，如印苦楝內酯通過抑制TNF-α介導的NF-κB和HDAC-3核轉位預防內毒素誘導的急性呼吸窘迫綜合征，HDAC3選擇性抑制劑RGFP966通過減弱NF-κB p65轉錄活性，在小鼠巨噬細胞和小鼠肺組織中發揮抗炎特性，HDAC3缺失通過調節NF-κB和TGF-β/Smad2/3信號通路抑制PM2.5誘導的小鼠肺損傷等[2，17～19]。然而，既往在肺損傷的研究中多是聚焦于HDAC3在肺泡巨噬細胞，肺泡1型上皮(alveolar type 1 epithelial，AT1)細胞和肺動脈內皮細胞中的作用，關于HDAC3在AT2細胞中的作用則鮮見報道[20～22]。

因此，本研究在小鼠AT2細胞中敲除HDAC3，為后續深入研究肺部疾病中HDAC3的生物學功能和相應的調控分子機制提供了安全、可靠的在體實驗動物模型。