HOXA11-AS/miR-149-3p通路在肺鱗狀細胞癌中的作用及機制研究

趙 靜 黃珺霞 唐秀花 王 紅

肺鱗狀細胞癌是一種常見的癌癥[1]。近年來，隨著臨床技術的不斷發展，肺鱗狀細胞癌的診療方法相比以前有了一定的進步[2, 3]。然而，手術、化療和放療等常規治療方法由于轉移、復發和耐藥等原因，并沒有明顯提高晚期患者的生存率[4, 5]。因此，深入研究和闡明肺鱗狀細胞癌的發生機制，對于該類疾病的診治具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)在癌癥的發生、發展過程中發揮了重要的作用[6～9]。研究發現，lncRNA在肺鱗狀細胞癌中處于異常表達的狀態，提示其可能與肺鱗狀細胞癌的發生、發展和預后相關。例如，LINC00511在肺鱗狀細胞癌中作為癌基因而發揮作用，有可能成為肺鱗狀細胞癌患者診斷的生物學標志物和治療靶點[10]。此外，lncRNA HOXA11-AS被確定為多種人類癌癥病理過程中的致癌基因，如胰腺癌和結直腸癌[11，12]。提示其可能在癌癥相關疾病中發揮著重要作用。然而，尚不清楚HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌中是否也具有重要的調控作用。非編碼小分子RNA(micoRNA，miRNA)是一類內源性非編碼短RNA，其長度為19～25個核酸，可與3′-非翻譯區結合，轉錄后可通過與mRNA結合，導致基因沉默[13, 14]。此外，據報道，miR-149-3p可以抑制某些人類癌癥的發生和發展，如骨肉瘤[15]。但是，miR-149-3p是否可作為HOXA11-AS的下游分子而介導肺鱗狀細胞癌的發展鮮見報道。SPT16是染色質轉錄促進復合體的重要組成部分，是一種組蛋白伴侶，其在基因轉錄、DNA復制和DNA修復過程中發揮重要作用。有趣的是，SPT16可以作為肺癌的預后指標[16]。然而，SPT16在肺鱗狀細胞癌中的作用尚不清楚。

因此，筆者研究了HOXA11-AS的表達水平及其對肺鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡和轉移以及腫瘤生長的影響，以及其與miR-149-3p和SPT16在肺鱗狀細胞癌可能的調控機制。

材料與方法

1.組織來源：收集2018年6月～2019年6月收治于筆者醫院的肺鱗狀細胞癌患者手術切除癌組織和癌旁組織30例。在切除手術中獲得癌組織及對應的相鄰正常組織，并立即保存在液氮容器中。所有受試者均符合肺鱗狀細胞癌的診斷標準，術前均未接受放療、化療或其他治療。所有患者均簽署知情同意書，本研究已通過筆者醫院醫學倫理學委員會審批。

2.細胞培養和轉染：人肺鱗狀細胞癌細胞系NCI-H226、NCI-H520、SK-MES-1和正常肺上皮細胞系BEAS-2B購自中國科學院細胞所(上海)。所有細胞均用含8%胎牛血清(以色列BI公司)的DMEM培養基(美國Gibco公司)培養在37℃含5% CO2的恒溫培養箱(美國Thermo公司)中。

靶向HOXA11-AS的小干擾RNA(siRNA)(si-HOXA11-AS)及其陰性對照(si-NC)、miR-149-3p 抑制劑(anti-miR-149-3p)及其陰性對照miR-NC抑制劑(anti-miR-NC)、miR-149-3p mimics (miR-149-3p)及其陰性對照miR-NC mimic (miR-NC)由中國上?；蛑扑幱邢薰驹O計合成。對于HOXA11-AS和SPT16的過表達，由漢恒生物技術有限公司(中國上海)構建相應的過表達質粒pcDNA-HOXA11-AS (HOXA11-AS)，同時，以非靶向質粒(pcDNA)為陰性對照。根據用戶手冊，使用Lipofectamine 3000將上述寡核苷酸或質粒轉染到肺鱗狀細胞癌細胞NCI-H520中。

3.定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)：使用RNA分離試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)從肺鱗狀細胞癌組織和配對的相鄰正常組織、肺鱗狀細胞癌細胞中分離總RNA。對于互補DNA (cDNA)的合成，使用1μg RNA，借助高容量cDNA反轉錄試劑盒。選用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix檢測HOXA11-AS和SPT16mRNA的表達。miR-149-3p分析使用all-in-one MIRNA RT-qPCR試劑盒。HOXA11-AS、miR-149-3p和SPT16的相對表達采用2-ΔΔCt方法進行評估。RT-qPCR研究中涉及的引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

4．MTT細胞增殖測定：用四甲基偶氮唑鹽細胞活力分析試劑盒(美國Sigma公司)檢測細胞活力。將轉染后的細胞接種于96孔板(200μl，3×103個/孔)。每孔加入10μl四甲基偶氮唑鹽(5mg/ml)繼續孵育4h，沉淀溶解于二甲基亞砜(100μl)中。在分光光度計下于490nm波長處測定吸光度(A)值。

5.Transwell實驗：細胞被胰酶消化，并放置在上室中，其中包含非涂層膜。下室加入600μl 1%胎牛血清。37℃孵育24h后，用棉簽去除膜的上表面，而下表面的細胞用0.1%結晶紫染色30min。為了進行侵襲試驗，按照試劑說明進行Matrigel小室實驗。收集轉染組細胞(200μl，5000個/孔)，懸浮于無血清培養液中，移入50μl的小室。在含10%胎牛血清的500μl DMEM培養液中培養過夜。將上表面的細胞刮去，將下表面的侵襲細胞固定，用0.1%結晶紫染色半小時。

6.雙熒光素酶報告基因試驗：利用miRcode和target Scan Human7.2在線軟件預測HOXA11-AS、miR-149-3p、SPT16的相互作用關系。構建了含有miR-149-3P野生型(WT)和突變型(MUT)結合位點的熒光素酶表達載體。進一步，將SPT16基因3′-UTR上miR-149-3p的WT或MUT結合位點克隆到pmirGLO載體(美國Rromega公司)中，構建了WT或MUT SPT16 3′-UTR熒光素酶表達載體。用脂質體2000將熒光素酶報告基因與miR-149-3p mimics和陰性對照分別共轉染入NCI-H520細胞。轉染48h后，用雙熒光素酶報告分析系統(Promega)檢測熒光素酶的相對活性，用螢火蟲熒光素酶活性進行歸一化。

7.統計學方法：本研究中的數據來自至少3個獨立的實驗。應用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行統計分析。差異通過Student′st檢驗(兩組數據)或單因素方差分析(3組數據)確定。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌組織和細胞系中高表達：為了明確HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌進展中的作用，筆者首先采用RT-qPCR方法檢測了HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌組織和配對的相鄰正常組織，以及在肺鱗狀細胞癌細胞系中的表達變化。結果顯示，與相應的正常組織和正常細胞對照比較，HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌組織和細胞中的表達更高(圖1)。

圖1 HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌組織(A)和細胞系(B)中上調*P<0.01,**P<0.001

2.沉默HOXA11-AS抑制肺鱗狀細胞癌進展：為了闡明HOXA11-AS是否參與了肺鱗狀細胞癌的發生過程，筆者使用小干擾RNA(siRNA)來特異性敲低HOXA11-AS的表達。與si-NC組比較，si-HOXA11-AS組的肺鱗狀細胞癌細胞中HOXA11-AS的表達顯著降低(圖2A)。此外，MTT實驗發現，與轉染si-NC的細胞比較，轉染si-HOXA11-AS的細胞存活率明顯降低(圖2B)。Transwell實驗結果也顯示，敲低HOXA11-AS后，腫瘤細胞的浸潤和遷移能力降低(圖2C)。上述研究結果表明，HOXA11-AS的敲低在體外阻礙了肺鱗狀細胞癌細胞的增殖。

圖2 HOXA11-AS的沉默抑制了肺鱗狀細胞癌的進展A.轉染后48h，檢測HOXA11-AS在細胞中的表達;B.MTT法分析轉染后24、48和72h細胞的細胞活力;C.Transwell法分析轉染后細胞的侵襲和遷移能力。*P<0.01，**P<0.001

3.HOXA11-AS通過ceRNA機制靶向調控miR-149-3p表達：現有研究表明，lncRNA可通過靶向結合minRNA來發揮其調控作用。在本研究中，筆者使用miRcode軟件搜索了HOXA11-AS的下游miRNA，發現HOXA11-AS可以與miR-149-3p結合，HOXA11-AS與miR-149-3p之間的結合位點如圖3A所示。與miR-NC比較，miR-149-3p mimics有效地提高了其在NCI-H520細胞中的表達(圖3B)。隨后的雙熒光素酶報告基因檢測進一步證實了HOXA11-AS和miR-149-3p之間的靶向關系，在細胞中，使用miR-149-3p mimics，導致HOXA11-AS WT的熒光素酶活性降低(圖3C)，而HOXA11-AS MUT的熒光素酶活性未見明顯變化(圖3D)。其次，筆者分析了肺鱗狀細胞癌組織和細胞系中的miR-149-3p水平，發現肺鱗狀細胞癌中miR-149-3p表達明顯降低(圖3E)。然后，筆者探索了HOXA11-AS對miR-149-3p表達的影響，發現沉默HOXA11-AS可上調細胞中miR-149-3p的表達；相比之下，HOXA11-AS的引入顯著降低了miR-149-3p水平(圖3F)。RT-qPCR檢測顯示，瞬時轉染anti-miR-149-3p成功下調miR-149-3p表達(圖3G)。如圖3H所示，轉染si-HOXA11-AS顯著抑制了轉染細胞的細胞活力，但同時引入anti-miR-149-3p幾乎消除了抑制作用。此外，如圖3中I和J所示，Transwell實驗結果與MTT結果一致。綜上所述，HOXA11-AS敲低可能通過增加miR-149-3p的表達而抑制肺鱗狀細胞癌的增殖。

圖3 HOXA11-AS直接與miR-149-3p相互作用A.miRcode預測的HOXA11-AS與miR-149-3p之間的潛在結合位點;B.通過RT-qPCR 檢測miR-149-3p表達;C、D.轉染了miR-149-3p或miR-NC的細胞在轉染48h后進行WT-HOXA11-AS和MUT-HOXA11-AS熒光素酶活性的雙熒光素酶報告基因檢測;E.通過RT-qPCR檢測肺鱗狀細胞癌細胞正常細胞中的miR-149-3p水平;F.RT-qPCR檢測轉染對照(空白)、si-NC、si-HOXA11-AS、pcDNA或HOXA11-AS 的肺鱗狀細胞癌細胞中miR-149-3p的表達;G.RT-qPCR檢測miR-149-3p抑制劑的敲低水平;H.MTT法分析轉染后24、48和72h癌細胞的細胞活力;I、J.Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。所有實驗都獨立重復3次

4.SPT16是miR-149-3p的直接靶點，HOXA11-AS通過靶向沉默miR-149-3p而上調SPT16：此外，筆者還利用TargetScanHuman 7.2尋找miR-149-3p的下游基因，發現了miR-149-3p與SPT16之間的結合區域。miR-149-3p與SPT16 3′-UTR的關系如圖4A所示。然后采用雙熒光素酶報告基因試驗驗證miR-149-3p與SPT16的相互作用。miR-149-3p mimics的使用顯著降低了NCI-H520細胞中WT-SPT16的熒光素酶活性，但對MUT-SPT16沒有影響(圖4中B和C)。隨后，采用RT-qPCR檢測SPT16在肺鱗狀細胞癌細胞株中的mRNA表達水平，結果表明，與相應的對照比較，SPT16在肺鱗狀細胞癌細胞株中呈高表達(圖4D)。此外，實驗進一步證明(圖4E)，在細胞中，miR-149-3p過表達導致SPT16mRNA表達量明顯減少，而當過表達HOXA11-AS后，SPT16mRNA表達量升高。因此，HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌中通過靶向沉默miR-149-3p來介導SPT16表達。

圖4 SPT16是miR-149-3p的直接靶點，HOXA11-AS通過靶向抑制miR-149-3p上調SPT16A.TargetScanHuman 7.2預測的miR-149-3p與SPT16之間的結合區域;B、C.雙熒光素酶報告基因檢測轉染miR-149-3p或miR-NC細胞中WT-SPT16的熒光素酶活性;D. SPT16在肺鱗狀細胞癌細胞系以及正常細胞的mRNA表達水平;E.檢測轉染對照(空白)、miR-NC、miR-149-3p、miR-149-3p + pcDNA或miR-149-3p+HOXA11-AS的SPT16mRNA水平。*P<0.01，**P<0.001。所有實驗都獨立重復3次

討 論

肺鱗狀細胞癌是一種惡性程度較高并且存活率很低的腫瘤[17]。筆者觀察到相比于正常肺組織和肺細胞系，HOXA11-AS在肺鱗狀細胞癌組織和細胞系中的表達更高，敲低HOXA11-AS抑制了肺鱗狀細胞癌細胞系的增殖和遷移能力。本研究進一步探索了HOXA11-AS、miR-149-3p和SPT16之間的靶向關系，得出HOXA11-AS直接靶向miR-149-3p, 而miR-149-3p可進一步調控SPT16而發揮作用。實驗數據表明，HOXA11-AS可以通過靶向沉默miR-149-3p而介導SPT16表達，本研究顯示，HOXA11-AS/miR- 149-3p/SPT16軸參與了肺鱗狀細胞癌進展。

研究發現，HOXA11-AS可作為某些癌癥病理過程中的誘導劑而發揮致癌作用。既往研究顯示，HOXA11-AS在癌組織中高表達，而敲低HOXA11-AS可抑制肺鱗癌細胞的增殖能力。因此，筆者旨在研究HOXA11-AS在肺癌中發揮作用的具體分子機制。通過在線軟件miRcode尋找到HOXA11-AS的靶向miRNA，并確定了miR-149-3p作為候選miRNA，隨后通過雙熒光素酶報告基因檢測進一步驗證。本研究數據顯示，與正常組織和細胞系比較，miR-149-3p在肺鱗狀細胞癌組織和細胞中明顯下調。此外，miR-149-3p的敲低部分逆轉了si-HOXA11-AS對肺鱗狀細胞癌細胞增殖的抑制作用。

為明確miR-149-3p所作用的下游靶基因，筆者使用TargetScanHuman 7.2進行生物信息學分析，確定了SPT16為miR-149-3p的候選靶基因，隨后通過雙熒光素酶報告基因檢測分析了兩者的研究關系。結果顯示，相比于正常組織和細胞系，SPT16的表達水平在肺鱗癌組織和細胞系中均顯著上調。肺鱗癌中SPT16的表達與HOXA11-AS的表達呈正相關。在功能上，過表達SPT16明顯逆轉了si-HOXA11-AS所介導的對肺鱗狀細胞癌細胞增殖的抑制作用。

綜上所述，HOXA11-AS可通過與miR-149-3p結合促進miR-149-3p下游靶基因SPT16的表達，進而增強肺鱗癌細胞的增殖能力。本研究明確了HOXA11-AS/miR-149-3p/SPT16軸在肺鱗癌中的作用及調控機制，為研究HOXA11-AS在肺鱗癌及其他腫瘤疾病中的作用及機制提供了理論依據。HOXA11-AS/miR- 149-3p/SPT16軸有望成為肺鱗狀細胞癌早期診斷和預后評估的分子標志物，針對HOXA11-AS/miR-149-3p/SPT16軸的靶向治療可能成為緩解肺鱗狀細胞癌等腫瘤的新手段。