附子聯(lián)合MPTP誘導(dǎo)肝陽上亢型PD小鼠亞急性模型與慢性模型的建立及比較

榮 華 劉得水 張靜艷 郭科東 渠麗麗 張曉杰 陸佰榮

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在中醫(yī)學(xué)中屬于“顫證”范疇，早在黃帝內(nèi)經(jīng)中就有“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”記載[1]。PD的病機(jī)是肝腎陰虛，水不涵木，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，導(dǎo)致筋脈失其儒養(yǎng)而致病[2]。主要病理變化是中腦黑質(zhì)和紋狀體多巴胺(dopamine，DA)含量降低，TH是DA生物合成中的限速酶，在PD腦組織中，表達(dá)明顯下降[3,4]。通常MPTP致PD小鼠模型作用明確，是目前常用的PD動(dòng)物模型之一。急性和亞急性模型被應(yīng)用的十分廣泛，但是上述模型損傷在短期內(nèi)恢復(fù)較快，而人類PD發(fā)病是一個(gè)長期的發(fā)展過程，因此需要一種能產(chǎn)生損傷并且保持時(shí)間長的動(dòng)物模型才能與臨床的病理變化更為接近[5,6]。中醫(yī)臨床診療PD的特點(diǎn)是“辨病與辨證結(jié)合”以往都是采用單純的疾病動(dòng)物模型而忽視了中醫(yī)藥自身特點(diǎn)，與中醫(yī)臨床實(shí)踐銜接不夠密切，因此本研究采用附子煎液灌服聯(lián)合MPTP不同周期誘導(dǎo)，旨在建立病證結(jié)合動(dòng)物模型，并通過行為學(xué)檢測、病理學(xué)檢測等手段驗(yàn)證慢性模型比急性模型更加穩(wěn)定這一優(yōu)勢，證明慢性模型在研究PD的發(fā)病機(jī)制方面更具有可靠性。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠60只，2～3月齡，體質(zhì)量為20～25g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001]。所有實(shí)驗(yàn)研究均符合中國倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。附子煎液由單味附子組成[生藥4g/(kg·d)，批號(hào):000001294]購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司。TH抗體購自美國Cell Signaling公司，批號(hào)(1)，SP法免疫組化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(批號(hào)：00011404)。

2.動(dòng)物分組、造模及給藥：小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、肝陽上亢PD亞急性組、肝陽上亢PD慢性組。肝陽上亢PD小鼠模型制備：附子煎液灌胃4周后，MPTP腹腔注射，肝陽上亢PD亞急性組給予25mg/(kg·d)共7 天，肝陽上亢PD慢性組給予25mg/(kg·d)，每3.5 天給藥1次，為期5周[7～9]。

3.麻痹震顫評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分:與正常小鼠相似，無任何癥狀；1分：豎毛、弓背、間斷性細(xì)小震顫，但活動(dòng)自如；2分：吞咽頻繁，頻繁性震顫，后肢張開，顫尾，活動(dòng)逐漸受限；3分：流涎，持續(xù)性震顫，四肢僵硬，活動(dòng)受限；4分：因全身麻痹而死亡[10]。

4.易激惹程度的評(píng)定3級(jí)：Ⅰ級(jí)為捉持小鼠頸部時(shí)尖叫、驚跳；Ⅱ級(jí)為捉持頸部時(shí)咬人；Ⅲ級(jí)為提尾時(shí)尖叫、驚跳甚至咬人或同籠小鼠頻繁打斗；上述情況不明顯為0級(jí)[11]。

5.爬桿實(shí)驗(yàn)：給藥前3 天，每天進(jìn)行1次爬桿訓(xùn)練。給藥結(jié)束后第3 天，每天進(jìn)行1次爬桿實(shí)驗(yàn)，持續(xù)到第7 天。制作直徑為1cm，長50cm頂部固定直徑為5cm的小球爬桿，用紗布纏繞防止動(dòng)物攀爬發(fā)生打滑現(xiàn)象。測試時(shí)將小鼠放置球上，記錄小鼠完全頭向下爬到桿底部的時(shí)間。小鼠每天進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為爬桿時(shí)間<4.01s；1分為4.01～8.00s；2分為8.01 ～12.00s；3分為>12.00s[12]。

6.轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：給藥前3 天，每天進(jìn)行1次轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練。轉(zhuǎn)速30r/min，訓(xùn)練時(shí)長3min，連續(xù)訓(xùn)練3 天。給藥結(jié)束后，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)以4r/min起始，加速度為0.12r/min，最大速度為40r/min，記錄小鼠在5min內(nèi)在轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間，即轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期[13]。

7.免疫組化法檢測TH陽性神經(jīng)元平均光密度：4%多聚甲醛固定腦組織，4℃保存72h后，脫水浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋。中腦黑質(zhì)區(qū)冠狀切片，65℃烘片6h，進(jìn)行脫蠟、水化處理后，開始TH免疫組織化學(xué)染色。

8.免疫印跡法檢測TH蛋白表達(dá)：冰上快速取出中腦黑質(zhì)區(qū)域[14]。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，SDS 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入 TH 抗體(1∶1000) 4℃ 過夜；二抗(1∶6000) 孵育2h，ECL 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，ImageJ 圖像分析軟件對免疫印跡條帶進(jìn)行密度掃描，以TH/GAPDH比較各組蛋白相對表達(dá)水平。

9.實(shí)時(shí)定量PCR法檢測TH mRNA表達(dá)：取60mg腦組織，加入600μl Trizol溶液，腦組織在冰上進(jìn)行勻漿處理提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增PCR。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。

結(jié) 果

1.各組小鼠一般狀態(tài)變化：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組和肝陽上亢PD慢性組小鼠均在給予MPTP 5～30min內(nèi)出現(xiàn)豎毛、弓背、肢體僵直、活動(dòng)受限、身體震顫等現(xiàn)象。模型組及肝陽上亢PD亞急性組在給藥后2～6h后逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)，肝陽上亢PD慢性組恢復(fù)時(shí)間明顯長于其余3組。

2.各組小鼠麻痹震顫水平的變化：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組和肝陽上亢PD慢性組小鼠均出現(xiàn)麻痹震顫的癥狀(P均<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組麻痹震顫評(píng)分升高(P<0.05)，且肝陽上亢PD慢性組麻痹震顫最為明顯(P<0.05,表1)。

表1 各組小鼠麻痹震顫評(píng)分

3.各組小鼠易激惹程度的變化：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組和肝陽上亢PD慢性組小鼠均出現(xiàn)性情變化，易激惹度提高(P<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組易激惹程度明顯提高(P<0.05)，且肝陽上亢PD慢性組的易激惹程度最為明顯(P<0.05,表2)。

表2 各組小鼠易激惹程度的變化(n=10)

4.爬桿實(shí)驗(yàn)：與正常組比較，模型組小鼠爬桿時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),肝陽上亢PD亞急性組小鼠爬桿時(shí)間較正常組有所延長(P<0.05)，肝陽上亢PD慢性組小鼠所用時(shí)間明顯長于其他3組小鼠(P<0.05,表3)。

表3 各組小鼠爬桿時(shí)間與得分對比

5.轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：與正常組比較，模型組小鼠、肝陽上亢PD亞急性組小鼠、肝陽上亢PD慢性組小鼠的在棒停留時(shí)間均有所縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而肝陽上亢PD慢性組小鼠在棒時(shí)間明顯短于其他3組小鼠(P<0.05,表4)。

表4 各組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間對比

6.各組小鼠免疫組化結(jié)果：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組小鼠黑質(zhì)TH平均光密度均有所降低(P<0.05)；但肝陽上亢PD慢性組降低的最為顯著(P<0.05,圖1,表5)。

表5 各組小鼠黑質(zhì)TH平均光密度比較

圖1 各組小鼠TH表達(dá)水平(免疫組化法，×200)A.正常組;B.模型組;C.肝陽上亢PD亞急性組;D.肝陽上亢PD慢性組

7.各組小鼠黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)比較：與正常組比較，模型組小鼠與肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組TH蛋白表達(dá)量均有所下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組的蛋白含量降低明顯，肝陽上亢PD慢性組表達(dá)量下調(diào)最為明顯(P<0.05,圖2)。

圖2 各組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)域TH蛋白表達(dá)差異A.TH免疫印跡圖;B.TH統(tǒng)計(jì)直方圖。與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05;與肝陽上亢PD亞急性組比較，ΔP<0.05

8.各組小鼠黑質(zhì)TH mRNA表達(dá)的比較：與正常組比較，模型組小鼠與肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組TH mRNA表達(dá)量均有所下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組mRNA含量降低明顯，其中肝陽上亢PD慢性組表達(dá)量下調(diào)最為顯著(P<0.05,圖3)。

圖3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)域TH mRNA的表達(dá)與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與肝陽上亢PD亞急性組比較，ΔP<0.05

討 論

PD是常見的神經(jīng)退行性疾病，詹姆斯·帕金森于1817年首次對PD進(jìn)行描述[15]。它是以DA神經(jīng)元選擇性丟失為主要特征的椎體外系疾病，多發(fā)生于老年群體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在60歲以上人群中發(fā)生率達(dá)到1%，即全世界有超過700萬人患病，這導(dǎo)致一系列家庭、醫(yī)療和社會(huì)問題[16]。因此，成功建立PD動(dòng)物模型是尤為重要的。既往采用MPTP誘導(dǎo)小鼠PD模型得到認(rèn)可，但該種模型與中醫(yī)藥自身特點(diǎn)不符[17]。附子為大熱之品，久用必耗傷精血，奪肝腎之陰而致肝腎陰虛，陰不潛陽而肝陽偏亢。肝陽上亢證是PD中的常見證型，臨床中應(yīng)用平肝潛陽藥物治療PD肝陽上亢證取得了較好的療效，采用灼傷肝腎之陰而發(fā)生肝陽上亢灌服附子煎液聯(lián)合 6-OHDA單側(cè)損毀的方法，從病和證兩方面綜合模擬肝陽上亢證PD模型，與單純PD模型和單純肝陽上亢證候模型比較，在研究治療PD藥效評(píng)價(jià)方面更具特色和優(yōu)勢[18,19]。將辨病論與辨證論有機(jī)結(jié)合起來，病證結(jié)合的動(dòng)物模型使很多“證”的不確定性因素由于“病”的限制變得清晰。

作為PD病理變化的主要特征黑質(zhì)致密部多DA能神經(jīng)元的丟失程度可導(dǎo)致疾病表現(xiàn)的差異。MPTP經(jīng)腹腔注射后可迅速進(jìn)入血-腦脊液屏障，生成MPP+與DA親和，破壞黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元，產(chǎn)生PD樣病理變化，因此被常用于建立PD模型的誘導(dǎo)藥物[20]。

附子煎液灌胃可以使小鼠出現(xiàn)煩躁，易激惹的表現(xiàn)，從而制備肝陽上亢證候模型[21]。PD具有周期長且呈進(jìn)行性發(fā)展的趨勢，因此需要能使損傷程度持久的模型這無疑是更接近于臨床的病理特點(diǎn)，研究表明，MPTP誘導(dǎo)的小鼠模型應(yīng)用較多的是急性或亞急性的模式，這種模型發(fā)生的損傷會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)得到恢復(fù)[22]。立足于此，本研究采用不同周期MPTP誘導(dǎo)聯(lián)合附子進(jìn)行周期灌胃，成功建立肝陽上亢PD亞急性模型及肝陽上亢PD慢性模型。

通過研究發(fā)現(xiàn)，模型組、肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組小鼠在給藥后均會(huì)出現(xiàn)豎毛、弓背、四肢僵硬、運(yùn)動(dòng)速度減慢，出現(xiàn)活動(dòng)受限的現(xiàn)象。但肝陽上亢PD慢性組恢復(fù)時(shí)間與其他組比較，恢復(fù)時(shí)間較長，其余組在給藥后2～6h內(nèi)可逐漸恢復(fù)正常。對小鼠易激惹程度的觀察，發(fā)現(xiàn)肝陽上亢PD小鼠易激惹程度更高，肝陽上亢PD慢性組小鼠表現(xiàn)的更為暴躁，出現(xiàn)捉頸時(shí)尖叫咬人，同籠打斗現(xiàn)象明顯多于其他各組。通過爬桿、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測小鼠行為學(xué)變化得知，與正常組比較，給藥各組小鼠均出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)能力及平衡能力的損傷，而附子與MPTP聯(lián)合用藥肝陽上亢PD慢性組較單純MPTP模型組及肝陽上亢PD亞急性組小鼠出現(xiàn)損傷程度更大，運(yùn)動(dòng)功能受損嚴(yán)重。行為學(xué)檢測結(jié)束后，對各組小鼠中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元標(biāo)志物TH進(jìn)行定位和定量的研究得知，給藥各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的TH表達(dá)量下降。與單純西藥模型組比較，肝陽上亢PD慢性組蛋白及mRNA表達(dá)含量降低的最為顯著，由此認(rèn)為肝陽上亢PD慢性組小鼠腦內(nèi)多DA能神經(jīng)元損傷程度較其余組要高。

綜上所述，通過增加MPTP給藥周期并聯(lián)合附子構(gòu)建小鼠肝陽上亢型PD慢性模型，從行為學(xué)、TH神經(jīng)元標(biāo)志物等方面分析比較可以初步驗(yàn)證，慢性模型是最穩(wěn)定貼近于PD臨床病理特征的建模方式，同時(shí)體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“辨病與辨證相結(jié)合”特點(diǎn)，將病證結(jié)合動(dòng)物模型建立并研究運(yùn)用，將會(huì)使中藥防治PD基礎(chǔ)研究更具有應(yīng)用前景。