小鼠頸部異位心臟移植模型的初步探索

劉一緯 楊鵬杰 魏起友

器官移植已成為治療終末期器官衰竭最有效的方法[1]。2022年1月7日，馬里蘭大學醫學院成功完成了一例豬心異種移植[2]。自1973年Corry等[3]首次建立小鼠心臟移植模型以來，如今常用的移植模型分為兩種，即腹部心臟移植和頸部心臟移植[4～6]。頸部解剖結構簡單，便于日后觀察供體心臟活動狀態；頸部創口小，全身反應輕，相比之下腹腔移植創傷大、時間長、感染概率高、腸管粘連可能性大[7]。在頸部移植模型中，袖套法(cuff技術)更適用于初學者，降低了手術難度，有效減少供心缺血時間[8]。因此，筆者對小鼠頸部心臟移植模型進行探索，總結建模經驗，分析要點難點，為研究移植免疫學打下基礎。

材料與方法

1.材料：選用近交系雄性C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠，8～12周齡，體質量為20～22g，購自內蒙古醫科大學實驗動物中心，并于內蒙古醫科大學實驗動物中心飼養，環境符合SPF級標準，實驗動物生產許可證號：SCXK(蒙)2020-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(蒙)2020-0003。單人雙目體視顯微鏡購自深圳奧斯微光學儀器有限公司；顯微手術器械購自上海醫療器械有限公司手術器械廠；4-0非吸收縫線購自揚州富達醫療器械有限公司；10-0帶針縫合線購自寧波醫用縫針有限公司；0.3mm×0.6mm、0.6mm×0.8mm四氟毛細管購自上海俊隆裝飾工程有限公司；0.4mm×0.5mm、0.8mm×1.0mm硬塑料毛細管購自南通伊諾精密塑膠導管有限公司；水合氯醛、HE染液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；肝素鈉注射液購自天津生物化學制藥有限公司；4%多聚甲醛固定液購自福州白鯨生物科技有限公司。

2.供體手術：小鼠麻醉(采用5%水合氯醛0.07ml/10g腹腔注射)、備皮、固定、消毒、鋪單，沿腹正中線剪開皮膚、肌肉，推開腸管找出下腔靜脈。下腔靜脈注射預冷(4℃)的肝素鹽水(100U/ml)1ml，等待1min后小鼠全身血液肝素化，剪斷下腔靜脈和腹主動脈放血。向上剪開膈肌，沿兩側腋中線剪斷肋骨，成倒“U”型打開胸腔暴露心臟，撕開心包膜使用冰鹽水(4℃ 0.9%氯化鈉溶液)滴注小鼠心臟，心跳逐漸緩慢至暫停。分離主動脈、肺動脈并于遠心端分叉處剪斷，使用10-0縫合線將上下腔靜脈、肺靜脈、左心耳集束結扎后剪去相應血管及組織，取下供心放置于4℃ 0.9%氯化鈉溶液中保存。

受體手術：小鼠麻醉(采用5%水合氯醛0.07ml/10g腹腔注射)、備皮、固定、消毒、鋪單，沿右鎖骨中線向上、下方切開頸部皮膚，上至小鼠下頜骨，下至鎖骨下0.5cm，暴露下頜腺并摘除。分離脂肪組織，游離頸外靜脈，于頸外靜脈遠心端分叉處用10-0縫合線結扎，近心端分離至鎖骨上方，用10-0縫合線打活結備用。去除胸鎖乳突肌，游離頸總動脈于遠心端分叉處用10-0縫合線結扎，近心端使用微型動脈夾夾閉血流。分別于遠心端結扎處剪斷頸動、靜脈，將血管斷端從備好的套管內部穿過，張開血管壁向外翻轉使其完全包裹套管，成功后用10-0縫合線結扎固定，使用肝素鹽水(100U/ml)沖洗血管套管端口預防血栓形成(圖1)。

圖1 血管套管外翻過程A.血管穿過套管；B.血管壁外翻；C.血管套管結扎

連接與術后：在受體頸動、靜脈血管套管下方放置10-0縫合線。將供心移至受體頸部，張開供心肺動脈斷端完全包裹受體頸靜脈套管端口，使血管套管進入肺動脈內，用預埋的10-0縫合線結扎肺動脈和頸靜脈完成靜脈連接。動脈連接方法與靜脈相同，供心主動脈包裹受體頸動脈端口完成套入，結扎連接。血管連接完成后，松開頸靜脈根部活結，打開頸動脈根部微型動脈夾，血液流通，供心滴注37℃ 0.9%氯化鈉溶液復溫，30～60s后可見供心復跳并逐漸恢復正常節律，用4-0縫線縫合頸部皮膚，傷口常規消毒。若術中出血過多，可皮下注射37℃ 0.9%氯化鈉溶液0.5～1.0ml補液，術后將小鼠放置于潔凈鼠籠內，25℃恒溫復蘇， 30～60min后小鼠蘇醒，正常飲水飼料喂養，每日觀察供心活動情況(心率、節律、強度)，詳見圖2。

圖2 心臟移植過程A.供體心臟；B.剪斷頸靜脈；C.夾閉頸動脈；D.外翻結扎；E.心臟連接；F.恢復跳動

3.失敗原因記錄：第1階段為訓練階段，指從零開始(無顯微外科基礎、無實驗動物模型建立經驗)至第1例模型建立成功(術后供心復跳，小鼠活動正常，持續3天以上視為手術成功，3天內供心停跳或小鼠死亡視為手術失敗)，統計每例小鼠死亡失敗原因。

4.分組處理：第2階段將小鼠按品系隨機分為同系組和模型組，同系組：C57BL/6小鼠作為供、受體；模型組：BALB/c小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體。每組完成18對小鼠模型，其中隨機選取9只統計供心存活時間，余下9只術后第7日取移植物組織。納入標準：術后供心復跳順利，心率、節律、強度正常，小鼠精神狀態良好、行為活動正常，持續3天以上視為手術成功，3天內供心停跳或小鼠死亡視為手術失敗，不計入統計。

5.心臟移植物存活時間：從術后第1天開始計算移植物存活時間，每天經小鼠頸部觸摸移植心臟跳動情況，心臟停跳視為移植物死亡，記錄存活時間(n=9)。

6.標本取材及HE染色：術后第7天取出供心，置于4%多聚甲醛固定液中，固定48h后按HE染液試劑盒說明書進行移植物心肌組織染色、封片。根據國際心肺移植學會(ISHLT)2004年修訂版的排斥反應診斷標準(表1)，光學顯微鏡下觀察并記錄移植心臟急性排斥反應組織病理學分級(n=9)[9]。

表1 移植排斥反應診斷標準(ISHLT2004年修訂版)

結 果

1.失敗原因比較：訓練階段共進行119次小鼠心臟移植手術，失敗原因按出現前后順序依次為：麻醉意外(14例，11.76%)、解剖結構不熟和顯微外科水平低(總結為手術操作不當，23例，19.33%)、血管套管外翻失敗(36例，30.25%)、供心結扎口出血(17例，14.29%)、靜脈連接處淤血(15例，12.61%)、環境溫度過低(3例，2.52%)、術后感染(9例，7.56%)和其他原因(2例，1.68%),詳見表2。

2.移植物生存期比較：生存期觀察以30天為終止，同系組9只全部存活，模型組存活時間(7.44±1.01天)較同系組明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見圖3。

圖3 生存曲線

3.移植物排斥反應程度比較：供心組織HE 染色后在 200 倍光學顯微鏡下觀察可見同系組心肌細胞結構基本完整，炎性細胞浸潤較少，病理分級多為0～1級(0級6只，1級3只)；模型組呈現中到重度急性排斥反應現象，心肌細胞結構受損，間質水腫、出血，大量炎性細胞浸潤，病理分級多為3～4級(3級4只，4級5只)，其排斥反應病理分級明顯高于同系組，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見圖4。

圖4 供心排斥反應組織病理學檢查(HE染色，×200)A、B.同系組，兩圖為同一組中不同個體的病理表現；C、D.模型組,兩圖為同一組中不同個體的病理表現

討 論

本實驗成功建立了小鼠頸部異位心臟移植模型，血管套管外翻是建模的重點難點，特別是頸動、靜脈血管的外翻操作[10]。因外翻失敗造成小鼠死亡36例，發生率為30.25%，是引起實驗失敗發生率最高的原因。當下套管常采用靜脈留置針導管制作而成，靜脈留置針導管外壁光滑，在血管內可自由滑動；導管材質軟，可隨血管進行一定程度曲折且更注重導管外徑，無內徑數據[11,12]。頸部血管套管外翻時因套管未固定，始終處于搖擺狀態造成外翻困難，若使用靜脈留置針導管，無詳細內徑數據不利于實驗研究，導管外壁光滑外翻后易滑動脫出，材質軟易曲折，更增加了外翻時晃動、彎折概率。考慮以上原因實驗初期選取質地更硬的四氟毛細管，根據血管粗細動脈選用0.3mm×0.6mm套管，靜脈選用0.6mm×1.0mm套管。循環血經供心流出后，動脈血變為靜脈血，血壓較低，若套管內徑不足易造成靜脈阻塞淤血，供心右心淤血復跳失敗，此原因造成小鼠死亡15例，發生率為12.61%。此外實驗前期采用微型動脈夾夾閉靜脈血流，由于動脈夾張力過大，松開后靜脈內壁粘連無法復張，進一步導致靜脈淤血，遂后期采用10-0縫合線打活結的方式阻斷靜脈血流，同時換用硬塑料毛細管，0.8mm×1.0mm套管作為靜脈管，0.4mm×0.5mm套管作為動脈管，改善了連接后靜脈淤血的情況。更換套管后，外徑變小動脈血管外翻時間縮短，也使得供心連接時動脈端口更容易套入主動脈內，節省了供心連接時間。因此在保持套管內徑的基礎上，選用外徑小、管壁薄但材質偏硬的套管，可以使血管外翻更加簡單、快速，避免靜脈淤血，提高成功率，節省手術時間。

操作過程中可能因解剖不熟練造成下頜腺及胸鎖乳突肌出血、供心主肺動脈撕裂、受體頸動靜脈破損等情況，此階段因手術操作不當致死23例，占總數的19.33%，是造成手術失敗的第2大原因。顯微外科技術(鏡下操作感、分離、打結、帶線、外翻等)需要花費時間練習，特別是對于沒有顯微外科基礎的初學者，會造成更高的死亡率和失敗率。開始可以先在鏡下無實物練習，適應操作感后用紗布練習縫合打結等基礎操作，最后再使用實驗動物進行手術。小鼠解剖結構獨特，右下頜腺血管位于腺體右上方，可自左下鈍性分離后去除；頸靜脈分支較多、胸鎖乳突肌深部血管及供心主肺動脈根部分離等均是易造成失敗的原因。

供心的摘取方式分為集束結扎和單獨結扎兩類[13]。集束結扎是指供心切斷主動脈、肺動脈后，一次性結扎除這兩根血管之外的其余血管，優點在于操作簡單，摘取速度快，減少供心缺血時間，利于復跳和長期存活，但缺點在于此法易形成出血。集束結扎一次結扎較多血管，若結扎后剪血管時殘端過短，易造成結扎口內有血管、組織脫出，使連接成功后供心出血。單獨結扎是指分別結扎上、下腔靜脈和左、右肺靜脈，優點在于解決了集束結扎易出血的問題，減少失敗概率，但缺點在于操作時間較長、供心缺血時間延長。本研究采用集束結扎法，訓練階段因出血致死17例，發生率14.29%，注意結扎時打4～5個結，同時結扎左心耳，且務必在剪斷多余血管時保留較長殘端，可避免供心出血的情況發生，此法使得供心恢復血流后復跳良好，未出現因冷缺血時間過長而導致的復跳失敗。另外供體手術的充分肝素化(預防血栓形成)和整個過程供心的低溫狀態也是需要注意的細節。

文獻中大多數動物模型均采用水合氯醛麻醉，本實驗麻醉劑量為5%水合氯醛(0.07ml/10g)腹腔注射[14,15]。從效果來看，麻醉致死14例(11.76%)，主要原因在于小鼠個體對水合氯醛的耐受性差異較大，麻醉藥物劑量依據小鼠體重而無法做到個體化給藥，造成麻醉過深或過淺的結果。同時動物麻醉后，靜脈血管擴張回流減少、心率血壓下降、體溫降低，在手術過程中及術后應注意保溫，溫度過低可能造成小鼠術中死亡和術后無法蘇醒，環境溫度過低造成3例死亡，發生率為2.52%，注意保溫即可避免此類事件的發生。把握麻藥劑量酌情給藥，手術環境及術后保溫是實施麻醉時應注意的關鍵點。同時尋找、研發一種新型的，具有更好麻醉效能和更少不良反應的麻醉藥物，具有重要意義。

術后感染造成9例小鼠死亡，發生率為7.56%。在小鼠頸部心臟移植模型中，手術部位較清潔，繼發感染情況較少，進行無菌手術后無需使用抗生素干預，嚴格執行無菌操作，提升手術間無菌環境即可。使用袖套法進行心臟移植，術后無血栓生成、無血管漏血滲血等情況發生，避免了吻合法在吻合口附近易繼發血栓影響術后血運通暢及血管斷端對合不良或針距偏大漏血等影響手術成功率的風險[16]。

第2階段進行分組對照研究，同系組移植物長期存活，無明顯排斥情況，模型組移植物存活時間短，排斥情況嚴重，其病理表現多為心肌細胞損傷、血管炎，間質水腫、出血，伴大量炎性細胞浸潤，是影響移植物早期存活的主要原因。在同種異體移植情況下，急性排斥反應的發生難以避免，且多發生于早期，移植術后5～7天即有明顯現象[17,18]。本實驗建立的小鼠頸部異位心臟移植模型，能夠產生明顯的急性排斥反應，為研究移植免疫學打下基礎。

綜上所述，本實驗對小鼠頸部異位心臟移植模型進行探索，分析建模過程中的要點、難點，總結各類致死原因并提出改進策略，為后人學習提供了完整的思路與經驗。頸部袖套法無需血管吻合，降低手術難度縮短手術時間，是一種特別適合無基礎初學者的術式，其中0.4mm×0.5mm、0.8mm×1.0mm套管的使用值得推廣與學習。