嗜黏蛋白阿克曼菌對腺嘌呤誘導慢性腎病大鼠作用的研究

高增輝 秦珍珍 栗鳳霞

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是威脅人類健康的全球性重要公共衛生問題，在全球不同地區其發生率高達6%～10%，目前尚無根治方法，最終進展至終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)[1]。近年來研究顯示，CKD患者本身腸道微生態失調及其腸道屏障功能受損，進一步加重了慢性腎臟病的進展[2]。

腸道微生態與人體的生理病理過程密切相關，具有營養腸上皮細胞、維護腸道屏障、免疫調節等作用[3]。既往有研究表明，腸道微生態失調與人體消化、心血管、內分泌及神經等系統疾病密切相關[4]。有研究者發現腸道微生態失調會造成腸道屏障破壞及通透性增加，導致病原體或其毒性代謝產物進入血液循環，進而加重疾病進展[5,6]。而筆者前期研究發現，CKD患者和健康對照者腸道微生態在多樣性和菌群結構存在明顯差異，CKD患者中阿克曼菌的豐度較健康對照組顯著降低[7]。本研究旨在探討阿克曼菌對CKD大鼠腎功能的影響作用及其可能機制，為CKD的預防及治療提供新的思路。

材料與方法

1.一般材料：健康6周齡SPF級SD大鼠26只，平均體質量約200g，購自山西省人民醫院實驗動物中心，許可證號：SCXK(晉)2019-0001。免疫印跡、免疫組化及病理染色等相關試劑購自賽文創新(北京)生物科技有限公司。ZO-1抗體(批號UH289284)及Claudin-1抗體(批號UB280983)購自美國賽默飛世爾科技公司公司，Occludin抗體(批號EPR20992)購自英國Abcam公司，β-actin抗體、羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗購自美國Immunoway Biotechnology公司(批號YM3028)。

2.A.muciniphila株的培養：A.muciniphila株培養物購自德國微生物菌種保藏中心。培養條件37℃，厭氧袋內，在哥倫比亞瓊脂培養基平板上培養48～72h。

3.動物分組及干預措施：26只SD大鼠隨機分為正常組8只、模型組8只、治療組10只，普通飼料喂養。正常組：予以灌胃0.9%氯化鈉溶液 1ml/d，4周；模型組：予以灌胃腺嘌呤200mg/(kg·d)，4周；實驗組：同時予以灌胃腺嘌呤200mg/(kg·d)和阿克曼菌1.5×109菌落形成單位/天(CFU/d)，4周。實驗期間觀察精神狀態、每周測量體質量。4周后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟穿刺采取大鼠血清，以下腹部正中切口入腹，切除左側腎組織稱重、同一節段結腸組織，-80℃凍存待檢。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準，經山西省人民醫院醫學倫理學委員會批準(倫理審批號：2021省醫科倫審字第29號)。

4.血清學指標檢測：采用全自動生化分析儀檢測血清肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)指標，根據說明書處理樣品和標準品。

5.Masson染色和過碘酸希夫(PAS)染色檢查腎臟及結腸組織病理學：Masson染色：常規脫蠟水化，用Regaud蘇木精染色，麗春紅酸性復紅液10min，冰醋酸水溶液浸洗，鉬酸水溶液分化，不經水洗，直接用苯胺藍染液復染，以冰醋酸水溶液浸洗片刻，封片及鏡檢。以損傷的腎間質膠原沉積面積與腎間質總面積的比值表示，0分為無病變；1分為局灶性(≤總面積25%)，2分為多灶狀(25%～50%)，3分為大片狀(50%～75%)，4分為彌漫性(>75%)，隨機觀察10個高倍鏡視野進行評分。PAS染色：石蠟組織切片常規脫蠟水化，過碘酸溶液中10min，希夫染液中18min，蘇木精染液10s，分化液5s，進行脫水、透明、封片及鏡檢。

6. Western blot法檢測大鼠結腸ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達：取適量結腸組織加RIPA裂解液，快速低溫勻漿，BCA法檢測濃度，取50μg總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉膜，5%脫脂奶粉液封閉，加入一抗(ZO-1稀釋比1∶250、Occludin稀釋比1∶1000、Claudin-1稀釋比1∶125)4℃孵育過夜。次日，加入二抗(羊抗兔吸稀釋比1∶10000、羊抗鼠稀釋比1∶10000)室溫孵育1.5h。超敏增強型化學發光試劑(ECL)顯色影，用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析。結果以與β-肌動蛋白(β-actin稀釋比1∶10000)的灰度比值表示。

7.免疫組化檢測結腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達：石蠟組織切片脫蠟水化，3%H2O210min。Tris/EDTA緩沖液，高壓修復。一抗(ZO-1稀釋比1∶62.5、Occludin稀釋比1∶200、Claudin-1稀釋比1∶100)孵育，4℃過夜。HRP標記二抗(羊抗兔稀釋比1∶1000)。DAB顯色，蘇木精10s，常規透明，封片。德國萊卡光學顯微鏡下雙盲法觀察切片中表達棕黃色顆粒的陽性細胞數情況，隨機觀察10個高倍鏡視野。根據文獻[7]染色評分標準如下：分別計數陽性細胞百分比(A)及陽性著色程度(B)。A：無陽性細胞記為0，陽性細胞比例0～1%記為1，陽性細胞比例2%～10%記為2，陽性細胞比例11%～30%記為3，陽性細胞比例31%～70%記為4，陽性細胞比例71%～100%記為5。B：陰性著色記為0，弱陽性染色記為1，中等強度染色記為2，強陽性染色記為3，總評分=陽性細胞比例評分+陽性染色強度評分。

結 果

1.大鼠Scr和BUN水平變化：模型組Scr、BUN水平明顯高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，經阿克曼菌干預后，實驗組Scr、BUN下降(P<0.01，表1)。

表1 3組大鼠Scr和BUN的比較

2.大鼠腎組織病變情況：PAS及Masson染色結果顯示，與正常組比較，模型組腎小管有不同程度的擴張，腎小管基膜增厚、屈曲，上皮細胞體積縮小，腎間質彌漫性纖維組織增生以及部分炎性細胞浸潤(P<0.01)；與模型組比較，經阿克曼菌干預后，實驗組腎臟組織腎小管擴張減少，腎小管基膜變薄，腎間質纖維化程度減輕(P<0.05，圖1)。

圖1 3組大鼠PAS及Masson染色結果(×400)*P<0.05，**P<0.01

3.Western blot法驗證A.muciniphila對腸道屏障的保護功能：結腸緊密連接位于上皮細胞頂部，參與維持腸道屏障，其中ZO-1、Occludin、Claudin-1是反映細胞間緊密連接完整性的敏感指標。實驗結果顯示，與正常組比較，模型組結腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實驗組ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達增多(P<0.05，圖2及表2)。

表2 3組大鼠結腸緊密連接蛋白表達

圖2 大鼠腸道緊密連接蛋白表達

4.大鼠結腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達情況：免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組結腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達明顯減少(P<0.05)，實驗組大鼠結腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表達增多(P<0.05，圖3)。

圖3 3組大鼠結腸組織緊密連接蛋白免疫組化染色及統計結果(×400)*P<0.05

5.A.muciniphila對大鼠結腸組織黏液層厚度及杯狀細胞的改善：與正常組比較，模型組結腸腺體萎縮、變形，黏液層厚度明顯減低，杯狀細胞密度降低(P<0.01)；與模型組比較，阿克曼菌干預的大鼠結腸組織黏液層厚度增加(P<0.05)，杯狀細胞密度升高(P<0.01，圖4)。

圖4 3組大鼠結腸組織PAS染色(×400)及統計圖A.3組大鼠結腸組織PAS染色結果；B.結腸組織黏液層厚度統計圖；C.結腸組織杯狀細胞密度*P<0.05，**P<0.01

討 論

目前，慢性腎臟病已經成為一項日益嚴重的全球性公共健康問題，我國慢性腎臟病患病率約為10%，且仍有逐年上升趨勢，已成為我國目前不容忽視的慢性疾病之一[8]。CKD患者由于飲食和腸腔環境有毒物質、pH值、抗生素應用、鐵吸收等的長期作用會出現腸道黏膜局部水腫糜爛，腸道微生態的多樣性紊亂，同時損傷腸道上皮細胞以及細胞之間的緊密連接，使腸道的滲透性增高，導致腸腔內的細菌和內毒素滲透入血循環中，加重疾病的進展[9,10]。

人體腸道微生態系統由腸道及龐大的微生物群落組成，它包含有300～500個細菌物種，是人體微生態系統最重要的組成部分。已有研究證明，腸道微生物可通過維持腸道屏障完整性，調節腸道局部免疫力，逆轉腸道微生態失調，抑制病原體的繁殖等機制，發揮著保護機體的重要作用[10]。研究研究發現膳食纖維、木炭吸附劑AST-120可通過調節腸道緊密連接蛋白表達改善腸道的通透性，進而延緩慢性腎臟病的進展[11,12]。另有研究發現，通過果糖誘導的代謝綜合征可致菌群紊亂、腸道屏障破壞，進而加重腎臟病的進展[13]。此外，有研究發現Lactobacillus菌可通過調節腸道環境，促進腸道緊密連接蛋白和TLR2的表達，降低腸道通透性，從而延緩CKD大鼠的腎損害[14]。

前期筆者通過高通量測序技術對56例CKD患者和38例健康對照者的糞便進行比較分析，發現CKD患者的腸道微生態的多樣性和菌群結構均發生變化。與健康對照者比較，CKD患者中阿克曼菌的豐度較健康對照組顯著降低(3.08% vs 0.67%)[15]。阿克曼菌是從人糞便中分離出的嚴格厭氧的腸道益生菌，它可以編碼一種特別廣泛的黏蛋白降解酶，降解黏液中的黏蛋白，產生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)，而短鏈脂肪酸具有減輕腸道炎癥、增強免疫以及抗腫瘤的作用[16,17]。

研究表明，阿克曼菌可以通過改變腸道微生態的多樣性和豐富度，逆轉腸道微生態，改善肝臟疾病的進展[18]。本研究發現，模型組大鼠結腸緊密連接相關蛋白表達明顯低于正常組，而阿克曼菌使得CKD大鼠結腸緊密連接蛋白中的胞內蛋白ZO-1、跨膜蛋白Occludin、Claudin-1表達增加，提示阿克曼菌干預可改善結腸上皮細胞間緊密連接完整性，改善腸道屏障功能。此外，有研究發現，在乙醇誘導的酒精性肝病大鼠中，予以阿克曼菌干預可減少肝功能損害及炎性細胞浸潤，促進緊密連接蛋白的表達，降低腸道滲透性，治療酒精引起的肝損害[19,20]。而本研究結果示，在阿克曼菌干預下，大鼠結腸組織杯狀細胞密度及黏液層厚度較模型組顯著增加，說明阿克曼菌可通過增加結腸上皮表面黏液生成，促進腸道屏障功能的恢復，減少有毒物質進入血液循環，從而改善CKD大鼠的腎損害。

綜上所述，本研究發現阿克曼菌可改善慢性腎臟病大鼠的腎功能以及腎間質纖維化，其作用機制可能與阿克曼菌改善腸上皮細胞間緊密連接結構的完整性、增加腸道上皮細胞分泌黏液進而保護腸道黏膜屏障功能有關。應用阿克曼菌保護慢性腎臟病患者的腸道屏障功能，可以為通過調節腸道益生菌分布延緩慢性腎臟病進展及改善預后等方面的進一步研究提供實驗基礎。