液相色譜串聯質譜法分析激素代謝譜在腎上腺疾病診斷中的應用進展*

陳璐璐綜述，劉傳鑫，段佳佳，江 濤，姜宏衛△審校

1.河南科技大學第一附屬醫院內分泌代謝中心內分泌代謝科/河南省遺傳罕見病醫學重點實驗室/國家代謝性疾病臨床醫學研究中心洛陽分中心，河南洛陽 471000；2.河南科技大學第一附屬醫院檢驗科，河南洛陽 471000

大氣壓離子化技術在20世紀80年代被科學家首次發明，它的出現進一步推動了液相色譜和質譜聯用技術的迅速發展[1]。近年來隨著液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術的不斷進步，其被應用于食品、醫藥、化工、環境等各行各業，特別是在臨床檢驗診斷方面，其發展的速度尤為迅猛[2]，已逐漸由科研應用轉變為用于臨床檢測和輔助診斷，為精準醫療提供服務。

自2010年以來，在內分泌領域涉及LC-MS/MS技術的臨床研究文獻每年增加超過100篇，研究內容主要涵蓋了新生兒遺傳代謝病、罕見病、激素代謝紊亂疾病等領域[3]。據報道，目前LC-MS/MS技術可同時篩查有機酸、氨基酸代謝及脂質代謝紊亂等多種代謝性指標[4]，在內分泌檢驗領域的應用有了飛速進展，為庫欣綜合征(CS)、原發性醛固酮增多癥(PA)等疑難病例的診斷及鑒別提供了更準確的檢測技術和新的特異性診斷標志物[5]。目前臨床實驗室采用傳統免疫學方法測定激素也暴露出諸多缺點：對激素代謝物的結構類似性不能進行特異性鑒別檢測；抗體交叉反應干擾；動態線性范圍狹窄，不能滿足檢測波動較大的激素水平的需求；對水平過低的激素檢測靈敏度較低等等。這些缺點一定程度上導致傳統免疫學方法已經不能滿足內分泌疾病領域全面精準診斷疾病的需求，而LC-MS/MS技術作為內分泌疾病診療領域新興的檢驗技術，因其靈敏度高、特異度高、一個標本多種檢測等優點，可為疾病診斷提供更精準、全面的診療信息[6]。本文通過對LC-MS/MS技術檢測類固醇代謝譜在腎上腺疾病診療領域中的應用進行深入闡述，以期能夠進一步提升其在內分泌疾病篩查診斷中的應用價值。

1 LC-MS/MS分析激素代謝譜

1.1激素代謝譜 人體內的激素是一種弱極性的小分子物質，主要產生于腎上腺、胎盤和生殖腺等器官，臨床上所測定的激素主要指包括糖皮質激素、鹽皮質激素、孕激素和性激素在內的類固醇激素，以及由腎上腺髓質分泌的兒茶酚胺(CA)類激素，這些激素的中間代謝產物包括11-脫氧皮質醇、皮質酮等20多種化學物質。類固醇激素是由膽固醇經過各種酶的催化反應，最終相互轉化為相應的激素來調節內分泌代謝[7]；CA類激素是一類應激擬交感激素，其產生部位主要在腎上腺髓質，對于人體最重要的CA類激素主要包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)。

1.2LC-MS/MS技術優勢 激素代謝譜檢測是目前臨床化學領域最具挑戰性的實驗室項目，因為許多激素代謝物具有相似的化學結構，對方法的特異度要求高，并且許多激素中間代謝物的水平很低，又存在結合、游離形式和性別、年齡之分，對方法的靈敏度要求也很高，即使大多數免疫學方法可測到10 pg/mL，但其準確度、特異度較差。LC-MS/MS技術適用范圍遠超過放射性免疫檢測和化學檢測范圍，它的物質水平檢測下限是其他常規免疫化學方法所無法相比的，最低檢測限可<4 pg/mL[8]，并且可同時檢測20多種激素代謝物水平，所以近年來LC-MS/MS的應用得到了廣泛的關注和發展。復旦大學中山醫院醫學檢驗科對LC-MS/MS檢測20種類固醇代謝物血漿樣品進行性能和方法學驗證，并采用LC-MS/MS技術檢測多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和亞臨床庫欣綜合征(SCS)患者血漿中20種類固醇激素，證實LC-MS/MS方法檢測類固醇代謝物可以很好地鑒別這兩種疾病患者與健康人群，進一步驗證了該方法的高特異度和靈敏度[9]。近年來國內外多數內分泌學家逐漸意識到LC-MS/MS檢測方法的高特異度和多種物質共分析等優勢，選擇其作為檢測類固醇激素優選方法，將LC-MS/MS應用于激素代謝譜檢測，以輔助篩查和診斷相關內分泌疾病。在檢測標本的選擇方面，LC-MS/MS技術不僅可以檢測血清標本中的激素水平，還可以檢測唾液、尿液、精液、卵泡液等體液標本，標本的可選擇范圍十分廣泛[10-11]。目前已有用LC-MS/MS測定血漿、唾液或者尿液中糖皮質激素的相關標本處理方法，特別是尿液游離皮質醇或者唾液皮質醇和可的松，以及微量的激素中間代謝物，相比免疫分析有很大的優勢[10]。采用LC-MS/MS測定血漿或者尿液中鹽皮質激素醛固酮，其靈敏度比免疫學方法高10倍[12]，并且一些性激素的檢測項目包括睪酮、雌二醇、孕酮等相關代謝產物，這些激素因性別、年齡和生理狀態不同水平差別很大，只有采用靈敏度高、線性范圍廣的LC-MS /MS技術才能覆蓋不同情況下的激素水平的差異性。

2 LC-MS/MS技術在腎上腺疾病診斷的臨床應用

2.1先天性腎上腺皮質增生癥(CAH)的篩查 CAH是一種常染色體隱性遺傳性疾病，由于基因突變引起體內類固醇激素合成過程中相關酶缺乏，導致腎上腺皮質激素合成障礙同時引起腎上腺皮質增生和激素代謝紊亂[13]。臨床上篩查CAH的常用方法為采集出生3 d的新生兒足跟血滴于特制的濾紙片上，采用時間分辨熒光免疫分析法或酶聯免疫分析法測定干濾紙血片中17-羥孕酮水平是否升高，然而由于免疫方法的交叉反應干擾，新生兒初篩的結果可能會出現假陽性，且假陽性率高[14]，而采用LC-MS/MS分析方法，對新生兒初篩陽性結果進行二級篩查，通過同位素內標法定量對類固醇激素代謝譜進行檢測，可盡可能避免基質和交叉反應的干擾。LC-MS/MS技術不僅可以檢測17-羥孕酮，還可檢測包括21-脫氧皮質醇、雄烯二酮、11-脫氧皮質醇等多種類固醇代謝物，并且計算代謝產物與前體的水平比值，例如(17-羥孕酮+雄烯二酮)/皮質醇或(17-羥孕酮+21-脫氧皮質醇)/皮質醇的比值，根據比值的大小可以判斷代謝途徑中酶的活性大小[15]。LC-MS/MS技術不僅可以有效降低假陽性率，提高準確度，還可以對21-羥化酶的經典型和非經典型進行診斷和分型。雖然通過CYP21A2基因分型檢測雜合子和無癥狀患者對遺傳咨詢很有價值，但成本高、檢測步驟復雜且結果較難獲得。通過LC-MS/MS技術同時測量促腎上腺皮質激素刺激的血清17-羥孕酮和21-脫氧皮質醇水平，可有效區分21-羥化酶缺乏的表型，COSTA-BARBOSA等[16]運用此方法成功篩選出92.3%的非經典型CAH患者和無癥狀患者，為CAH的診斷分型提供了更全面的參考信息。

2.2PA的篩查與分型 PA是由于腎上腺皮質病變導致自主性醛固酮分泌過多引起水鈉潴留并進一步抑制腎素血管緊張素系統所致，其主要臨床表現為高血壓伴低鉀血癥[17]。PA患者的治療方案根據腎上腺分泌醛固酮的情況而定，單側腎上腺分泌醛固酮過多可通過腎上腺手術治愈，雙側腎上腺均過多分泌醛固酮則需要終生接受鹽皮質激素拮抗劑的治療[18]，在臨床上鑒別單側腎上腺腺瘤(APAs)還是雙側腎上腺增生(BAH)引起的PA需要通過腎上腺靜脈采血(AVS)并測量雙側腎上腺靜脈血內的醛固酮和皮質醇水平是否存在顯著差異來判斷。EISENHOFER等[19]評估了LC-MS/MS技術檢測類固醇代謝譜對PA患者進行分型的效用，證實該方法優于傳統的醛固酮和皮質醇免疫分析方法，并擴展了18-羥皮質醇等作為鑒別PA不同亞型的額外生物標志物，同時提供數據說明BAH和APAs患者腎上腺激素生成模式的差異可以轉化為外周靜脈血類固醇譜的差異，通過對外周靜脈血激素類固醇代謝譜的差異性分析也可用于對PA亞型的分類。臨床上高血壓患者常規篩查PA主要是通過測定醛固酮與腎素活性比值(ARR)進行，需要抽血檢測并且有采血時間及采血體位要求，運用常規免疫分析方法進行檢測，標本前處理復雜，檢測成本較高。馬文君等[20]研究的采用LC-MS/MS技術檢測24 h尿醛固酮水平，能夠有效地避免測定血液醛固酮和腎素時受到激素脈沖式分泌的影響，較單次測定血醛固酮水平更能反映醛固酮的整體分泌情況，并且在對高血壓患者進行PA篩查時測定24 h尿醛固酮的特異度和靈敏度較高，具有更好的臨床應用價值，并且尿液相對于血液留取更方便，通過應用LC-MS/MS技術測定可將尿皮質醇、尿甲氧基腎上腺素類物質等其他內分泌性高血壓相關的激素進行同步檢測，實現了一次檢測篩查多種疾病。在國家衛生健康委員會臨床檢驗中心2019年實行的《全國內分泌正確度驗證計劃》顯示，常規采用免疫學方法檢測的醛固酮水平結果普遍較實際靶值偏高，而采用LC-MS/MS技術檢測的結果更接近于實際靶值，進一步說明了LC-MS/MS技術在臨床檢驗領域具有很廣闊的應用前景[21]。

2.3CS的篩查與診斷 CS是由于腎上腺皮質分泌過多皮質醇導致以滿月臉、向心性肥胖等多種內分泌代謝紊亂伴隨精神心理異常的一組綜合征。除了典型的CS患者之外，還有部分皮質醇分泌異常而缺乏典型高皮質醇血癥臨床表現的患者，稱為SCS[22]，還有部分患者是在進行常規CT掃描檢查中偶然發現存在腎上腺無功能性意外瘤，在健康人群和這3種疾病患者之間，血液、尿液皮質醇水平的差異性呈現“連續性”升高，即從正常分泌到明顯升高間的皮質醇水平界限并不明確，各種類型之間存在激素水平重疊，這種分界不明確現象造成CS鑒別診斷十分困難，因此迫切需要尋找一種靈敏度和特異度高，能夠區分患者、亞臨床患者和非患者的檢測方法來對CS進行篩查和診斷，而LC-MS/MS技術憑借其高靈敏度和特異度被作為篩查和診斷CS的首選方法。

對于CS的初始篩查，內分泌學會指南推薦以下試驗之一：1 mg地塞米松抑制試驗(DST)或深夜唾液皮質醇(LNSC)或24 h尿游離皮質醇(UFC)測量。CECCATO等[23]在一系列患者中檢查了上述幾種測試的診斷性能，證實在疑似皮質醇增多癥的患者中，通過LC-MS/MS測量UFC在診斷CS方面實現了最優準確度，建議用LC-MS/MS測量UFC作為診斷CS的一線篩選方法，用1 mg DST或LNSC試驗測定來進一步確診高皮質醇血癥。由于皮質醇在唾液中的水平極低，因此對分析方法的靈敏度要求較高，2013年有研究報道采用LC-MS/MS測定唾液皮質醇[24]，通過采用LC-MS/MS對皮質醇化合物結構進行特異性分析，避免了免疫法檢測中出現可的松等內源性激素化合物和強的松龍等外源性激素類藥物的交叉反應所造成的干擾，使檢測的特異性更高，并且LC-MS/MS檢測皮質醇下限可達到0.07～0.11 nmol/L[25]，除了超高靈敏度外，LC-MS/MS在評估唾液標本中是否存在潛在污染或外用合成類固醇激素干擾方面非常有效。臨床上如果出現免疫法檢測唾液皮質醇值大于參考值上限的20倍，但患者臨床癥狀卻并不典型，懷疑是否為外源性藥物干擾引起的結果偏高，這種情況可采用LC-MS/MS技術根據唾液游離皮質醇和可的松的化合物檢測譜峰的差異進行區分來判斷干擾物來源。

由于目前各個國家研究所選取的CS患者和對照組的對象不盡相同，導致研究所得的診斷切點值也各不相同，通常臨床上將LC-MS/MS檢測24 hUFC診斷CS的切點值定義為170 nmol/24 h[26]，與2014年所發表文獻中提到的診斷CS的UFC切點為166～170 nmol/24 h[27]的結果是相近的，但該切點值對于一些亞臨床、輕微患者的診斷仍然缺乏敏感性。目前國際上對于LNSC的檢測還沒有較一致的診斷CS的切點值，需要同時采用LC-MS/MS和免疫法檢測24 hUFC,但隨著LC-MS/MS技術的普及，采用LC-MS/MS同時檢測LNSC和24 hUFC將成為提高診斷CS的靈敏度和特異度的有效方法。目前國內外研究熱點中不僅是采用LC-MS/MS測定皮質醇，而且進行皮質醇及其代謝產物或糖皮質激素代謝指紋譜的分析，這將為臨床精準診療提供更好的支持。

2.4嗜鉻細胞瘤(PPGL)的篩查和診斷 PPGL是起源于神經外胚層嗜鉻組織的腫瘤，主要分泌CA，PPGL患者可因長期高血壓導致嚴重的心、腦、腎損害或者因突發嚴重高血壓而導致高血壓危象，危及生命[28]。CA可代謝為3-甲氧基酪胺(3-MT)、3-甲氧基腎上腺素(MN)、3-甲氧基去甲腎上腺素(NMN)。PPGL以往常規篩查生化指標包括血液、尿液中的CA和尿香草扁桃酸等，缺乏診斷特異性，最新的研究結果顯示MN和NMN相較于常規篩查的生化指標對PPGL的輔助診斷具有更高的臨床價值，特別是血漿中的游離MN和NMN水平，其代謝的半衰期較CA長，因此診斷性能較CA更加穩定，可更直觀地反映腫瘤細胞的分泌狀態[29]。國內外關于PPGL的診療指南[30-31]中提到，診斷PPGL首選的生化指標為CA，MN、NMN、NE、E和DA可協助診斷，并推薦采用LC-MS/MS進行激素檢測。黃斐等[32]建立了LC-MS/MS平臺檢測MN和NMN的方法，參考范圍設定為MN<64.97 pg/mL和NMN<185.83 pg/mL，當患者MN和NMN結果均低于參考范圍上限時，可基本上排除患有PPGL的可能，若患者MN或NMN任意一項超過參考范圍上限，即可初步診斷為PPGL，通過運用ROC曲線分析所得出的特異性診斷切點為參考范圍上限的2.04倍和1.99倍，若患者MN和NMN均高于參考上限但未達到特異性診斷切點時，則推薦進一步檢測血MN和尿分餾MN,以排除假陽性升高的情況。SMY等[33]考慮到由于血漿里非常低的內源性3-MT水平(<0.1 nmol/L)導致常規免疫方法難以檢測，因此開發了一種簡單的3-MT測量方法：使用固相微萃取進行樣品制備，將洗脫液直接注入LC-MS/MS進行分析并以多反應監測模式采集數據，這種方法可以準確測定患者標本中的3-MT，為臨床醫生診斷或監測PPGL提供有價值的信息，并且在標本中MN和NMN水平正常的患者如果存在高水平的3-MT可提醒臨床醫生該患者可能患有分泌激素的腫瘤。由于CA及其代謝物的化學性質不穩定，存在眾多干擾物，并且在血液和尿液中的水平較低，因此準確測定其水平是當前臨床檢測難題，LC-MS/MS技術能夠進行大量的血液和尿液樣品的快速篩查，激素代謝物檢測下限更低，亟待廣泛應用，但由于實驗室間所選用的檢測儀器和廠家不完全相同，尚未建立CA及其代謝物的統一參考方法和參考區間，導致實驗室室間質評無法有效進行，是當前臨床檢驗亟待解決的問題[34]。

3 LC-MS /MS 技術臨床應用局限性

LC-MS/MS 技術與現有的臨床實驗室中廣泛使用的生化免疫技術相比，具有靈敏度高、特異性好、檢測下限低和高通量檢測等諸多優勢，特別是對于臨床檢測小分子激素及代謝產物有重要意義，但在國內臨床實驗室的使用率卻不高。分析其原因包括幾個方面：首先，由于質譜檢測原理與臨床生化免疫檢測不同，導致檢測結果之間存在一定差異，同一激素水平參考區間的設立由于檢測方法間的區別往往不完全一致，這就給臨床醫生診療疾病帶來困惑；其次，LC-MS/MS技術目前的臨床實驗室檢測方法大多數是由儀器廠家和實驗室聯合開發的自建方法，主要服務于本實驗室內部的相關檢測項目，在市場上缺乏相應的可以通用的檢測試劑盒以及質控品，導致各實驗室的檢測結果難以溯源其公認的參考方法或參考物質，并且不同實驗室所選用的儀器、標準品、試劑也存在差異，不同儀器類型所建立的方法學也存在差異，導致LC-MS/MS技術的實驗室標準化面臨很大困難，加上色譜質譜儀的運行維護成本普遍較高，且自動化程度不高，與目前臨床實驗室已經普及的全自動生化儀、化學發光儀等檢測儀器相比，LC-MS/MS技術較低的自動化程度限制了其在臨床實驗室的普及[35]；最后一方面也是最為重要的一點，目前在臨床檢驗領域中應用LC-MS/MS技術的行業政策、標準指南等一系列指南規范性文件出臺較少，對于各地區普及LC-MS/MS技術缺乏一個全面指導和建議，并且LC-MS/MS檢測設備目前還處于一個快速發展的階段，但有臨床應用相關證書的設備往往卻并不是最新研發的檢測設備，導致設備更新換代也滯后，在醫療市場應用方面，LC-MS/MS檢驗項目針對醫療機構的收費定價、準入等方面也缺乏相關的規定和政策[36]。以上這些原因均制約了LC-MS/MS技術在臨床實驗室的推廣和應用。

4 小 結

雖然LC-MS/MS技術在推廣應用過程中仍存在較大的挑戰，但是隨著國家對質譜技術臨床應用的關注度提高以及國內外醫療器械生產廠商、醫療機構對LC-MS/MS技術的不斷研發和提升，隨著各種指南和政策文件的相繼出臺，目前存在的困難正在被逐步解決。總之，LC-MS/MS技術在內分泌激素檢測領域已展現出強大應用優勢，不僅可與現有常規生化免疫自動化檢測技術互補，在發現及驗證腎上腺疾病新的潛在生物標志物方面亦將發揮重要作用。