自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能改變實驗研究

溫雅璐，吳宏輝，黃舉凱，王 姍，張 力，官 臻，王建華，楊曉暉

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3. 首都兒科研究所轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，北京 100020)

近年來，糖尿病已成為威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題之一。我國作為世界第一糖尿病大國，成年人的糖尿病患病率高達(dá)11.2%[1]，而2型糖尿病約占所有糖尿病患者的90%～95%[2]。各種臨床試驗表明，在射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭患者中，糖尿病的患病率可達(dá)45%[3]。因此，糖尿病可顯著增加患者發(fā)生不良心血管事件和心力衰竭的風(fēng)險。糖尿病心肌病作為2型糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其臨床特征主要為舒張功能障礙和心肌硬度增加導(dǎo)致的心力衰竭[4-5]。然而，目前尚無專門針對糖尿病心肌病的治療方法，因此亟須建立穩(wěn)定可靠、重復(fù)性高且符合人類糖尿病心肌病的動物模型以探討其發(fā)病機(jī)制并尋求治療藥物。目前應(yīng)用較為廣泛的糖尿病心肌病模型為誘發(fā)性動物模型，但該模型成模率較不穩(wěn)定且需要對注射方法及劑量進(jìn)行摸索，自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠因其具有先天性胰島素抵抗的特性，已作為肥胖和輕度高血糖的動物模型廣泛應(yīng)用于對人類2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的探究[6]，但其在糖尿病心肌病的研究中應(yīng)用尚少。因此，本研究擬通過對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠心功能檢測和病理學(xué)觀察等，評估其是否為糖尿病心肌病模型，并探究其在糖尿病心肌病研究方面的應(yīng)用價值，為后續(xù)藥效實驗的開展提供依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性12周齡KKAy小鼠24只，體重(36.90±1.91)g；SPF級雄性12周齡C57BL/6J小鼠24只，體重(27.71±1.03)g。小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008]，在首都兒科研究所SPF級實驗動物房[SYXK(京)2017-0030]常規(guī)飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，每12 h交替照明。KKAy小鼠給予高脂飲食，C57BL/6J小鼠給予普通飼料，飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均自由進(jìn)食飲水。該研究由首都兒科研究所實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(DWLL2021013)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2實驗試劑 伊紅染液(北京Solarbio公司，貨號：G1100)；蘇木素染液(北京Solarbio公司，貨號：G1140)；改良Masson三色染色試劑盒(北京Solarbio公司，貨號：G1346)；載玻片(江蘇世泰CITOTEST公司，貨號：188105W)；蓋玻片(江蘇世泰CITOTEST公司，貨號：10212424C)；中性樹膠(北京Solarbio公司，貨號：G8590)。

1.3主要儀器 羅氏活力血糖儀及其配套試紙(上海羅氏制藥有限公司)；全封閉式組織脫水機(jī)(德國Leica公司)；全自動組織包埋機(jī)(德國Leica公司)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國Leica公司)；高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)(美國Visual Sonics公司)。

1.4實驗方法 12周齡KKAy小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，禁食12 h，尾靜脈取血，測定空腹血糖，選取空腹血糖≥13.9 mmol/L小鼠為糖尿病模型成立小鼠，作為模型組；24只同周齡的C57BL/6J小鼠作為對照組。實驗過程中觀察小鼠的活動狀態(tài)、毛色、精神狀態(tài)、飲食、二便情況，每周測體重。2組小鼠于14，18，22，26周齡按隨機(jī)原則各取6只，行超聲心動圖檢查，獲取小鼠經(jīng)胸廓二維、M模式超聲心動圖和脈沖波多普勒譜成像，記錄小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、舒張期左室前壁厚度(LVAWd)、舒張期左室后壁厚度(LVPWd)、二尖瓣口血流多普勒E/A、二尖瓣環(huán)組織多普勒e’/a’和E/e’；處死前禁食12 h，尾靜脈取血，用血糖儀測定小鼠空腹血糖水平；麻醉小鼠，開胸取出心臟，冰鹽水清洗后稱重，切取心臟左室部分心肌放入4%多聚甲醛組織固定液固定、脫水、石蠟包埋、制片，行HE染色、Masson染色，在光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變及心肌膠原纖維染色情況。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)分布，不滿足正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗，滿足正態(tài)分布且方差齊時組間比較采用獨立樣本t檢驗，不齊時采用t’檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組小鼠14，18，22，26周齡體重及空腹血糖變化比較 14，18，22，26周齡的模型組小鼠體重、空腹血糖水平均明顯高于同期對照組(P均<0.05)，且均隨周齡增長逐漸增高。見表1。

表1 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠14，18，22，26周齡體重及空腹血糖比較

2.22組小鼠14，18，22，26周齡心臟結(jié)構(gòu)及功能學(xué)指標(biāo)比較 對照組24只、模型組22只(在22周和26周超聲檢測過程中各死亡1只)小鼠完成心功能檢測。不同周齡模型組小鼠的LVAWd和LVPWd均明顯高于同期對照組(P均<0.05)，且隨周齡增長逐漸增加。不同周齡模型組小鼠的二尖瓣口血流多普勒E/A、二尖瓣環(huán)組織多普勒e’/a’均明顯低于同期對照組(P均<0.05)，且隨周齡增長逐漸降低；而E/e’均明顯高于同期對照組(P均<0.05)，且隨周齡增長逐漸增高；2組小鼠的LVEF比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，均在正常范圍內(nèi)。見表2。

2.32組心臟組織HE染色病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡下觀察，各周齡對照組小鼠的心肌細(xì)胞排列整齊、致密，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核呈卵圓形；模型組小鼠14周齡時出現(xiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞間隙增大、空泡樣變，可見炎癥細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞浸潤等病理變化，且隨周齡增長病理變化逐漸加重。見圖1。

圖1 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心臟組織HE染色表現(xiàn)

2.42組心臟組織Masson染色病理變化 光鏡下觀察，模型組小鼠各周齡均可在心肌間質(zhì)及血管周圍觀察到膠原纖維(呈藍(lán)色)，且膠原纖維面積均明顯大于對照組(P均<0.05)，同時可見膠原纖維將心肌分隔成島狀。見圖2及圖3。

圖2 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心臟組織Masson染色表現(xiàn)(×400)

圖3 KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠心肌間質(zhì)及血管周圍膠原纖維面積

3 討 論

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和飲食結(jié)構(gòu)的改變，全球糖尿病人群的數(shù)量逐年增長，糖尿病心肌病的發(fā)病率也呈逐漸升高的趨勢。糖尿病心肌病是發(fā)生于糖尿病中的心肌功能失調(diào)，其獨立于已知病因如高血壓、心臟瓣膜疾病、冠心病及其他心臟病因素所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂和多元醇通路激活等因素有關(guān)[7]，因此，亟須探索穩(wěn)定可靠的動物模型進(jìn)一步探討糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制并評價藥物的有效性及安全性。

動物模型與人類疾病的相似程度是判斷模型價值的重要標(biāo)準(zhǔn)，目前用于研究糖尿病心肌病的動物模型主要包括誘發(fā)性糖尿病心肌病模型和自發(fā)性糖尿病心肌病模型。誘發(fā)性糖尿病心肌病模型常采用單純高脂或高糖飲食[8-9]或高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合小劑量多次腹腔注射鏈脲佐菌素誘發(fā)[10-11]，然而該類模型存在造模時間較長、操作流程較為繁瑣等問題，且通過人為限定方式誘發(fā)與疾病的自然進(jìn)程存在一定差異，實驗發(fā)現(xiàn)小鼠模型雖然產(chǎn)生了類似2型糖尿病的癥狀，但并未出現(xiàn)肥胖[12]。此外，大多數(shù)實驗在研究過程中僅以血糖作為前期篩選模型的方式，增加了此類模型的不穩(wěn)定性。

KKAy小鼠是在KK小鼠的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入突變基因(Ay)的2型糖尿病動物模型，可在遺傳和環(huán)境因素的共同作用下出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥、脂質(zhì)代謝紊亂和肥胖等2型糖尿病典型表現(xiàn)[13]，與人類2型糖尿病的病因非常相似。C57BL/6J小鼠呈黑色，與KKAy小鼠具有基因同源性，故本研究選擇該類小鼠作為正常對照。本研究通過連續(xù)監(jiān)測14，18，22，26周齡小鼠體重及空腹血糖發(fā)現(xiàn)，所有KKAy小鼠的空腹血糖均持續(xù)高于13.9 mmol/L，且體重及空腹血糖均顯著高于對照組，表明經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)后，KKAy小鼠的體重及血糖會維持較高水平。為進(jìn)一步觀察KKAy小鼠是否可作為糖尿病心肌病模型，本研究對其進(jìn)行心臟功能學(xué)和心臟病理學(xué)觀察。既往研究發(fā)現(xiàn)，在16，18，22，24周齡KKAy小鼠心肌間質(zhì)均可觀察到大量膠原纖維的沉積，而在C57BL/6J小鼠心肌組織中未觀察到相關(guān)病理表現(xiàn)[14-17]。此外，有研究對KKAy小鼠心肌組織行電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)其在16周齡時已出現(xiàn)閏盤附近肌絲紊亂、Z帶消失和脂質(zhì)樣空泡聚集等表現(xiàn)，且病變程度隨時間不斷加重直至40周齡；同時，20周齡KKAy小鼠心臟組織在電鏡下存在心肌細(xì)胞胞漿疏松、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核腫脹、線粒體腫脹、嵴消失等特點，超微結(jié)構(gòu)表明KKAy小鼠心肌組織存在一定的病理改變[18-19]。本研究動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，14周齡KKAy小鼠的心肌細(xì)胞已出現(xiàn)排列紊亂、細(xì)胞腫脹、心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞間隙增大、空泡樣變等表現(xiàn)，其間可見炎癥細(xì)胞浸潤，同時除心肌間質(zhì)外，心肌組織血管周圍亦有大量膠原纖維沉積，且隨周齡增長逐漸增加，這些均與既往研究結(jié)果一致，證實KKAy小鼠心臟組織存在心肌纖維化的病理特征。超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，14周齡KKAy小鼠已出現(xiàn)心肌肥厚的特征，左心室心肌參數(shù)較對照組均顯著增加，且隨時間延長室壁厚度穩(wěn)定增加，表明長期慢性損傷及負(fù)荷過重可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)而引起左心室室壁厚度增加。

本實驗選擇小鼠二尖瓣口血流多普勒E/A、二尖瓣環(huán)組織多普勒e’/a’及E/e’評估心臟舒張功能。心臟舒張功能為心肌主動松弛和心室被動充盈的能力，其中二尖瓣口血流多普勒E/A主要依據(jù)瓣口左房室之間的壓力階差反映左室舒張功能，E波為舒張早期二尖瓣血流速度，反映左心室的主動松弛功能，A波為舒張晚期二尖瓣血流速度，反映左心室被動擴(kuò)張的功能[20]；二尖瓣環(huán)組織多普勒e’/a’則可直接反映整個舒張期左室壁心肌的運動情況，主要受左室機(jī)械運動的影響，較少受心臟前后負(fù)荷的影響，e'波為舒張早期充盈峰值速度，a’波為舒張晚期充盈峰值速度[21]；由于E/e’可反映左心室充盈壓，且受到左心收縮功能影響較小，故可將其作為評估心室舒張功能的指標(biāo)[22]。因此，作為了解心臟舒張功能的經(jīng)典方法，本研究將三者結(jié)合使用以提高對心臟舒張功能評價的敏感性。既往研究發(fā)現(xiàn)，在16周齡KKAy小鼠中可觀察到E/A顯著小于C57BL/6J小鼠[14]，同時在其他2型糖尿病心肌病小鼠中可觀察到其心臟功能學(xué)指標(biāo)E/A和e’/a’均顯著降低，而E/e’顯著升高[23]。本研究中KKAy小鼠E/A、e’/a’自14周齡起均顯著低于對照組，且隨時間變化比值逐漸減小，而E/e’顯著高于對照組，且隨時間變化比值逐漸增加，與其他2型糖尿病心肌病小鼠心臟功能學(xué)指標(biāo)結(jié)果一致，符合人類2型糖尿病心肌病的關(guān)鍵特征，表明KKAy小鼠在早期已出現(xiàn)心臟舒張功能降低，且隨疾病進(jìn)展逐漸加重，但2組小鼠的LVEF均在正常范圍。目前研究發(fā)現(xiàn)眾多患有2型糖尿病且伴有心血管疾病的患者存在心臟舒張功能障礙，然而在此類患者中未檢測到心臟收縮功能障礙，且糖尿病心肌病隨疾病進(jìn)展最終可演變?yōu)樯溲謹(jǐn)?shù)保留的心力衰竭(HFpEF)[24]。此外，與射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭(HFrEF)相比，HFpEF為心力衰竭住院更常見的原因[25]。因此，亟須探索更符合糖尿病心肌病臨床特征及發(fā)病特點的動物模型，而KKAy小鼠是較符合糖尿病心肌病特征的動物模型。

研究表明，持續(xù)血糖升高可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生肥大、變性、壞死，同時出現(xiàn)心肌纖維化和心肌僵硬度增加，從而使得心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，進(jìn)一步導(dǎo)致耗氧量增加及心肌缺血，使得心臟在早期出現(xiàn)舒張功能障礙[26]。因此，糖尿病心肌病的結(jié)構(gòu)改變特征主要包括左心室室壁厚度增加、心肌纖維化、心肌細(xì)胞脂肪沉積等；功能改變特征主要為左室射血分?jǐn)?shù)保留的心臟舒張功能障礙[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，KKAy小鼠自14周齡起，持續(xù)的高糖狀態(tài)可加重心室重構(gòu)及心肌纖維化，進(jìn)一步引起心室舒張功能異常，其心功能改變與心臟結(jié)構(gòu)及心肌病理變化基本吻合。因此，自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠雖然成本及生存條件要求較高，但其造模穩(wěn)定，死亡率低，且更為符合糖尿病心肌病疾病特征，可提高研究效率，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本和時間成本。

綜上所述，KKAy小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)后血糖持續(xù)升高，且心室室壁厚度穩(wěn)定增加，并伴有持續(xù)性心肌纖維化及心臟舒張功能障礙等特征，更加符合糖尿病心肌病的發(fā)病特征，且與人類2型糖尿病心肌病臨床特征及病程進(jìn)展相符，證明它是較為穩(wěn)定的糖尿病心肌病模型，但其具體發(fā)病機(jī)制還需再進(jìn)一步驗證。本結(jié)果為深入研究糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為后期治療藥物研究提供了有效的動物實驗?zāi)Ｐ突A(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。