鈦表面ALD構建氧化鋅納米薄膜及其性能研究

孫汪心悅，舒 菲，張志豪，陳 虹，敦芷悅，呂瑋瑾，張青紅，劉 梅

近幾十年來，口腔醫學領域對鈦材料的需求呈顯著上升趨勢。鈦和鈦合金憑借其強度高、質量輕、生物相容性好等優點[1-3]，被廣泛應用在種植、活動修復等多個方面。然而，人體口腔是一個開放、復雜的環境，細菌密度高、數量多[4-5]，患者長期使用鈦材料過程中容易發生細菌感染，如種植體周圍炎、義齒性口炎等[6-7]。目前，臨床上對口腔細菌感染性疾病的防治多采用機械清潔、抗生素等方法，治療效果不穩定，易造成抗生素濫用和口腔微生態失衡，使細菌產生耐藥性[8]。

為了研究鈦材料表面的抗菌改性，人們已做出多種嘗試[9-10]。現階段，口腔鈦材料表面改性的抗菌劑可分為有機和無機兩大類，有機抗菌劑(抗生素、抗菌肽等)存在易產生耐藥菌株、易失活、易剝脫等問題[11]；無機抗菌劑多以金屬/金屬氧化物為主，如銀、銅、氧化鋅等，具有廣譜抗菌性[12-14]。氧化鋅作為無機抗菌劑的重要代表，被證實可以通過破壞細菌細胞膜、產生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等可能的機制發揮抗菌作用[15-16]。納米氧化鋅由于具有高比表面積，對細菌的親和力更強，抗菌效率也更高[17]。

常見的鈦表面制備氧化鋅的方法包括水熱法、電泳沉積法、磁控濺射法等[18]，但這些方法存在一些局限性，例如水熱法制備過程耗時、涂層成分相對單一，電泳沉積和磁控濺射法在精確調控涂層厚度的參數上還需進一步優化改進等。20世紀70年代，芬蘭的Suntola博士首次提出原子層沉積(atomic layer deposition，ALD)的概念，這是一種氣相薄膜沉積技術，憑借其獨特的自限制化學吸附過程，可以通過控制反應循環次數精確調控薄膜沉積厚度，最終在三維襯底上形成均勻、致密、高質量的納米級目標薄膜[19-21]。

本實驗擬利用ALD技術，在光滑純鈦表面制備不同沉積周期的氧化鋅納米薄膜，評估其理化性能和生物安全性，研究不同沉積周期的氧化鋅對金黃色葡萄球菌的體外抗菌效果，為口腔新型抑菌鈦材料的設計提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

純鈦試件(TA3，盛達興金屬材料有限公司，中國)，SiC砂紙(鷹牌，中國)，拋光膏(美耐特，中國)，丙酮、無水乙醇(分析純，國藥，中國)，小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1，ATCC，美國)，α-MEM培養基(Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Gibco，美國)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(Gibco，美國)，CCK-8試劑盒(Beyotime，中國)，金黃色葡萄球菌(S.aureus， ATCC25923)(ATCC，美國)，胰酪大豆胨培養基粉(TSB)(海博，中國)，瓊脂粉(Biofroxx，德國)，4%多聚甲醛(Biosharp，中國)，超聲波清洗機(XO25-12DT，南京先歐儀器，中國)，ALD反應倉(MNT-S200-L3S1，MNT Micro and Nano Co., Ltd，中國)，場發射掃描電子顯微鏡(MAIA3-TESCAN，捷克)，能譜儀(ULTIM MAX 170-OXFORD，英國)，X射線衍射儀(Rigaku SmartLab SE，日本)，水接觸角檢測儀(Dataphysics OCA20，德國)，多功能酶標儀(SpectraMaxM2e，MD，德國),倒置顯微鏡(DMIL LED，Leica，德國)，細菌濁度計(WGZ-2XJ，上海昕瑞儀器，中國)。

1.2 制備與表征

1.2.1 純鈦試件的制備 制備厚1 mm、直徑分別為6、15 mm兩種規格的圓片形純鈦試件。區分正反面，正面為實驗面，反面刻有劃痕作為區別。樣品正面經400、600、800、1 000目的砂紙逐級打磨，并用1 500、2 000、3 000、4 000目直至10 000目的拋光膏逐級拋光，使表面光滑并呈現出金屬光澤。分別用丙酮、75%乙醇和去離子水超聲清洗樣品各30 min，重復2次，烘箱烘干，真空包裝待用。將試件隨機分為4份，根據ALD技術參數的不同進行實驗分組，A為光滑鈦組，B為300循環組，C為600循環組，D為1 200循環組。

1.2.2 純鈦表面氧化鋅納米薄膜的ALD制備 使用ALD反應倉在鈦片表面制備氧化鋅薄膜，選擇二乙基鋅(DEZn)為鋅源前驅體，水(H2O)為氧源前驅體，反應溫度200 ℃，反應氣壓19 Pa，載氣量20 mL/min。將鈦片正面朝上擺放于反應倉的有效反應區內，水脈沖30 ms，氮氣吹掃20 s，共50循環，之后開始反應過程：先通入二乙基鋅脈沖30 ms，等待5 s，氮氣吹掃25 s；再通入水脈沖30 ms，等待5 s，氮氣吹掃30 s，以此為一個生長周期(循環)。此次實驗制備300、600、1 200循環的共3組樣品。反應方程式為：

Ti-OH + C2H5-Zn-C2H5→Ti-O-Zn-C2H5+ C2H6↑，

Ti-O-Zn-C2H5+ H2O→Ti-O-Zn-OH + C2H6↑。

1.2.3 場發射掃描電子顯微鏡(SEM)和能譜儀(EDS) 選擇直徑15 mm的A、B、C、D組試件，正面噴金后用SEM在200 000倍下觀察表面形貌，同時在每個試件正面隨機選取3個點，用EDS檢測薄膜元素組成。

1.2.4 X射線衍射儀(XRD) 選擇直徑15 mm的A、B、C、D組試件，用XRD(靶材Cu，管電壓40 kV，電流30 mA)檢測薄膜的晶型。

1.2.5 水接觸角 選擇直徑15 mm的A、B、C、D組試件，在正面隨機選取3個點，用水接觸角檢測儀檢測薄膜的親水性。

1.2.6 橢偏儀 選擇直徑15 mm的B、C、D組試件，在正面隨機選取3個點，用橢偏儀檢測鍍膜的厚度。

1.3 純鈦表面氧化鋅納米薄膜的細胞毒性

1.3.1 細胞培養 將凍存的MC3T3-E1細胞系體外復蘇后，加入α-MEM培養基(含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液)，在37 ℃、95%相對濕度、5% CO2細胞培養箱中靜置培養，每2～3 d換液。顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞密度達80%后進行傳代。

1.3.2 CCK-8實驗 選擇直徑15 mm規格的試件，清洗消毒后，按照ISO-10993-5標準制備A、B、C、D組樣品浸提液，采用完全培養基浸泡鈦片并放置于細胞培養箱中24 h。制備30 000個/mL的MC3T3-E1細胞懸液，按每孔100 μL的量接種于96孔板中，放入細胞培養箱中培養。24 h后，棄舊培養基，PBS潤洗，每孔加入100 μL材料浸提液，培養1、3、5、7 d。在各時間節點取出孔板，加入CCK-8試劑，避光孵育2 h，用酶標儀檢測各孔溶液在450 nm處的光密度，讀取OD值并進行分析。

1.3.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態 同上述實驗步驟，在材料浸提液培養細胞的第1、7天，用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態，并進行對比分析。

1.4 純鈦表面氧化鋅納米薄膜的抗菌性評價

1.4.1 細菌培養 選擇金黃色葡萄球菌作為抗菌性評價的實驗菌株，配制滅菌的胰酪大豆胨液體培養基(TSB)和胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)待用。將凍存的金黃色葡萄球菌體外復蘇，接種于TSA平板上，放入37 ℃、5% CO2細菌培養箱培養直至長出單菌落。用TSB培養基配制細菌懸液，細菌濁度計確定菌液濃度，稀釋調整為1×106CFU/mL的密度待用。

1.4.2 光密度法 選擇直徑15 mm的A、B、C、D組試件放置于24孔板中，將金黃色葡萄球菌菌懸液以1×106CFU/mL的濃度接種在材料表面，每孔菌液1 mL，放入細菌培養箱培養，24 h后用酶標儀檢測菌液的光密度值，讀取OD值并進行數據分析。抗菌率計算公式為：抗菌率=(OD值光滑鈦組-OD值實驗組)/OD值光滑鈦組×100%。

1.4.3 SEM觀察細菌形態 選擇直徑6 mm的A、B、C、D組試件放置于96孔板中，將金黃色葡萄球菌菌懸液以1×106CFU/mL的密度接種在材料表面，每孔菌液100 μL，放入細菌培養箱培養，24 h后加入1 mL 4%多聚甲醛4 ℃冰箱過夜固定。之后樣品用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液梯度脫水10 min，室溫下干燥。干燥后的樣品表面噴金，用SEM觀察各組樣品表面的細菌形態。

1.5 統計學分析

實驗結果采用SPSS22.0軟件進行處理，定量數據的表示形式為平均值±標準差，通過單因素方差分析檢驗組間差異，采用LSD檢驗進行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 理化性能結果

2.1.1 SEM結果 圖1示，光滑鈦片經過逐級打磨拋光，表面平滑，但仍可見細小的劃痕和凹坑。B、C、D組鍍有氧化鋅薄膜的樣品表面覆蓋了致密、均勻的結晶層，具有明顯的晶粒形狀，未見裂紋、氣孔等缺陷。隨著沉積周期數的增加，B、C、D組鍍膜的晶粒尺寸逐漸變大。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組

2.1.2 EDS結果 圖2顯示了各組樣品內主要元素(Ti、Zn、O、C)含量的變化。A組不含有Zn元素，B、C、D組含有Zn元素，且Zn、O元素含量隨著ALD沉積周期數的增加而增加。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組

2.1.3 XRD結果 如圖3所示，對比標準物質數據庫可知，35°～36°的衍射峰來自鈦基底，30°～38°的另外3個衍射峰屬于氧化鋅晶體，分別為(100)、(002)、(101)3個晶面。A組未檢測到明顯的氧化鋅晶體衍射峰，B、C、D組樣品中，隨著ALD沉積周期的增加，氧化鋅晶體的3個衍射峰整體強度增強，半高寬(FWHM)變窄，未表現出對鈦基底表面生長氧化鋅晶體某一晶向的抑制。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組

2.1.4 水接觸角 如圖4所示，A組的水接觸角為81.42°±1.89°，表現為親水。B、C、D組樣品的接觸角較A組增加，表現為疏水，依次為100.15°±0.88°、97.32°±2.46°、103.70°±1.61°，與A組之間有顯著的統計學差異(P<0.000 1)。B組與C、D組之間未表現出統計學差異，而C、D組之間存在統計學差異(P<0.05)。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組；*：P<0.05，****：P<0.000 1

2.1.5 橢偏儀 B、C、D組試件表面氧化鋅薄膜的厚度依次為(59.54±2.01)、(106.19±0.08)、(214.95±2.57)nm。對實驗組試件的鍍膜厚度進行線性擬合，分析得出氧化鋅薄膜厚度與ALD沉積周期數之間存在線性關系(圖5)，氧化鋅薄膜的生長速率(生長速率=鍍膜厚度(?)/循環數，10 ? = 1 nm)約為1.74?/循環。

圖5 橢偏儀結果的線性擬合Fig.5 Linear fitting of ellipsometer results

2.2 細胞毒性結果

2.2.1 CCK-8實驗 如圖6所示，經過1、3、5、7 d，A、B、C、D組浸提液共培養的MC3T3-E1細胞密度隨時間增加而增大，且均未表現出明顯的細胞毒性，組間無統計學差異。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組

2.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態 如圖7所示，第1、7天，A、B、C、D組浸提液共培養的MC3T3-E1細胞形態無明顯差異，細胞貼壁生長，平鋪伸展，呈現長梭形，細胞核、細胞膜邊界清晰。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組

2.3 抗菌性評價結果

2.3.1 光密度法 如圖8所示，與金黃色葡萄球菌共培養24 h后，B、C、D組與A組之間有較顯著的統計學差異(P<0.001)，B、C、D組組間的OD值均存在統計學差異(P<0.05)；共培養48 h后，B、C、D組與A組之間存在較顯著的統計學差異(P<0.001)，B組與D組之間統計學差異顯著(P<0.01)，C、D組之間表現出統計學差異(P<0.05)。計算得培養24 h B、C、D組平均抗菌率依次為33.6%、51.4%和65.9%；培養48 h B、C、D組平均抗菌率依次為36.1%、40.5%和52.3%，均表現出明顯的抗菌效果，其中D組抗菌效果最好。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

2.3.2 SEM觀察細菌形態 如圖9所示，A組表面的金黃色葡萄球菌呈現圓球形，表面光滑、完整，形態規則，成對或呈葡萄串珠狀排列；B、C、D組表面的金黃色葡萄球菌形態出現了不同程度的變化，呈不規則皺縮，有些出現了細菌胞膜破裂。

A：光滑鈦組；B：300循環組；C：600循環組；D：1 200循環組

3 討 論

本研究利用ALD技術，在光滑純鈦表面分別制備了300、600、1 200循環的3組氧化鋅納米薄膜。通過SEM可以發現， 200 000倍電鏡放大下的光滑鈦表面平滑，可見一些細小的打磨劃痕。沉積了氧化鋅后，B、C、D組鍍膜觀察到均勻、致密的晶體層，晶粒尺寸隨著沉積周期數的增加而增大。EDS結果表明，B、C、D組薄膜的主要元素組成為Zn、O，沉積周期數越大，Zn、O元素含量越高。結合XRD檢測，證實B、C、D組薄膜成分為氧化鋅晶體，出現了(100)、(002)、(101)3個晶面的特征性衍射峰，隨著沉積周期數的增加，3個衍射峰整體強度增強，半高寬(FWHM)變窄。根據Scherrer公式，衍射峰的半高寬可以判斷晶體晶粒尺寸的大小，半高寬越窄，意味著晶粒尺寸越大，晶體的結晶度越高[22]，這個結果與本實驗中SEM觀察到的形貌一致。

橢偏儀結果顯示，ALD制備的氧化鋅薄膜厚度為納米級，沉積周期與薄膜厚度之間符合線性關系，其生長速率約為1.74?/循環，與文獻提供的參考值1.6～1.9?/循環相符[23]。綜合上述實驗結果，本實驗制備的氧化鋅納米薄膜致密、均勻，生長速率穩定，有著通過改變沉積周期參數精準調控薄膜厚度的典型特點和優勢。

細胞毒性CCK-8實驗結果顯示，4組樣品浸提液培養的MEC3T3-E1細胞數量在1～7 d呈逐漸增長趨勢，與光滑鈦組相比，各實驗組均未表現出明顯的細胞毒性。倒置顯微鏡觀察可見各實驗組培養的細胞在1、7 d的形態與光滑鈦組均無明顯差別，細胞貼壁生長、形態良好。結合以上結果，B、C、D組氧化鋅納米薄膜具有良好的生物安全性。

本實驗體外抗菌結果顯示，B、C、D組氧化鋅納米薄膜24 h抗菌效果明顯，抗菌率分別為33.6%、51.4%和65.9%；48 h后，菌液OD值有所上升，但各實驗組的抗菌率依然維持在36.1%、40.5%和52.3%，D組在24 h和48 h的抗菌率是3個實驗組中最高的，與B、C組之間存在統計學差異。Song等[24]的研究表明，材料的疏水性可以抑制細菌生物膜的黏附，口腔齦上環境的波動剪切作用也使得疏水表面的生物膜更易脫落。經檢測，A組光滑鈦的水接觸角為81.42°±1.89°，表現為親水，B、C、D組氧化鋅薄膜的水接觸角分別為100.15°±0.88°、97.32°±2.46°、103.70°±1.61°，較A組增大，表現為疏水。這種改變可能來自原子層沉積的反應過程，前驅體二乙基鋅需要與基底材料表面的羥基進行結合，從而使材料帶有鋅元素，這個反應會消耗掉材料表面的羥基，使材料與空氣界面表現為水接觸角的增大。也有學者認為，ALD沉積金屬氧化物的疏水性并非金屬氧化物本身固有的特性，而是來自材料表面對碳氫化合物的吸附[25]。研究表明，親水性的骨植入材料表面傾向于在植入初期促進細胞黏附與增殖分化[26-27]。然而，親水性并非影響材料植入初期穩定性的唯一因素，材料的化學組成、表面形貌、粗糙度等也與之相關[28]。此外，臨床推廣的不同品牌、型號種植體的水接觸角也存在巨大差異，有研究總結了部分商業種植體表面親水性的現有發表數據，數值分布在0°～150°[28-29]。

目前，氧化鋅的抗菌機制依然不明確，但結合文獻可以大致歸納為3個方面：①釋放游離鋅離子破壞細胞膜的極性狀態，或與胞內蛋白酶分子結合使之結構改變；②直接與細胞膜表面接觸發生作用，使胞膜變性導致損傷；③受可見光激活產生大量氧自由基(ROS)，破壞胞膜進入菌體內殺菌[15-16，30-31]。結合體外抗菌實驗、橢偏儀實驗結果及ALD反應過程可得，ALD沉積周期數越高則氧化鋅薄膜的厚度越厚，氧化鋅含量越高，可使更多的細菌胞膜變性、破壞直至細菌損傷，故D組表現出最好的抗菌效果。同時SEM觀察可知，B、C、D組材料表面的金黃色葡萄球菌存在不同程度的皺縮和破裂，與A組正常狀態下飽滿、完整、串珠狀外觀形成鮮明對比，由此推測，氧化鋅破壞了細菌的胞膜完整性。然而，該過程是否與產生ROS有關，有待進一步研究。此外，ALD技術參數調節對氧化鋅納米薄膜抗菌效應的具體影響、氧化鋅鋅離子釋放與抗菌作用的關系等問題，也需更多的探索。

綜上所述，本研究利用ALD技術在光滑純鈦表面制備了不同沉積周期的氧化鋅納米薄膜，薄膜均勻、致密，厚度隨沉積周期數增加而增加，具有良好的生物安全性和明顯的體外抗金黃色葡萄球菌效果，其中D組(1 200循環)在各實驗組中抗菌效果最好。