嚙齒類動物種植體周圍炎模型構建的研究進展及應用

戴雨薇，李 潔，孫媛元，吳軼群，孟 箭

種植體周圍炎是種植體周圍組織的病理狀態(tài)，以種植體周圍黏膜炎癥和支持骨的進行性喪失為特征[1]。據(jù)報道，種植體十年累計生存率約為94.6%[2]，該生存率受種植體周圍炎的影響，且將隨著時間的推移而增加[3]。目前臨床上種植體周圍炎的治療沒有循證醫(yī)學證據(jù)和有效方案[4]，因此深入研究種植體周圍炎的發(fā)病機制、探索有效的治療方案尤為重要。

雖然非嚙齒類動物模型已經(jīng)獲得了有價值的信息，但由于各種條件的限制，它們并不具備進一步研究種植體周圍炎發(fā)病機制的優(yōu)勢。本文將對嚙齒類動物種植體周圍炎動物模型的構建、研究進展及應用進行綜述。

1 種植體周圍炎動物模型構建的概述

1.1 非嚙齒類動物模型

種植體植入模型已經(jīng)成功地在不同的動物物種中被構建[5]。小型豬的牙周組織與人類的牙周組織有許多相似之處[6]，有研究人員利用豬來分析評價去皮瓣種植術后不同時間段種植體周圍骨的炎癥程度[7]。犬類也是較常用的動物模型，性格溫順，且在人體使用的植入物可以在犬身上直接測試，Park等[8]利用犬評估即刻種植構建周圍炎模型的有效性，同時測試再生療法治療種植體周圍炎的效果。兔也是研究牙周疾病炎癥基礎和愈合模式的常用模型。兔在相對較早的年齡就達到骨骼成熟，在進行更多的繼發(fā)性骨重塑方面具有優(yōu)勢[9]。Sousa等[10]利用兔建立了鈦表面污染的種植體周圍炎的實驗模型，但兔在骨成分和骨重建方面與人類的相似性較小[11]，且兔模型實驗檢測手段、技術相對受限。雖然非嚙齒類動物牙齒的解剖結構與人類相似，但這些動物模型同時也具有價格昂貴，需要專門的飼養(yǎng)和維護設施等顯著缺點。

1.2 嚙齒類動物模型

與大型動物模型相比，嚙齒動物的飼養(yǎng)成本相對較低，且在炎癥過程中的相互作用方面已有了大量的研究數(shù)據(jù)[12]。因此，越來越多的學者選擇嚙齒類動物(主要是大鼠和小鼠)作為構建種植體周圍炎的動物模型，本文將對此展開闡述。

2 近年來研究中構建的嚙齒類模型

2.1 嚙齒類動物的品系

在種植體周圍炎嚙齒類動物模型中C57BL/6J小鼠的應用最為廣泛。Hiyari等[13]分別用C57BL/6J、C3H/HeJ、A/J型小鼠構建模型，研究結果證明C57BL/6J小鼠在結扎組中骨丟失最多，其次是C3H/HeJ和A/J；在組織學上，C57BL/6J小鼠的中性粒細胞和破骨細胞數(shù)量最多，且C57BL/6J小鼠表現(xiàn)出最活躍的骨重建。在種植體周圍炎大鼠模型中常用的大鼠品系有SD、Wistar、Lewis等，其中SD大鼠與Wistar大鼠的應用較為廣泛。

2.2 種植體設計

小鼠與大鼠在植入時需特制尺寸的種植體，小鼠微種植體的總長度一般為1.0～1.7 mm，直徑一般為0.5～0.8 mm。大鼠微種植體的總長度一般為2.0～4.5 mm，直徑一般為0.8～2.0 mm，目前尚無統(tǒng)一規(guī)格，研究者們多根據(jù)實驗需要自行定制，主要包括圓柱形和錐形種植體，尺寸各異。

2.3 植入位點

在關于植入位點的研究中，大小鼠模型中以上頜第一磨牙作為植入位點較為普遍。在大鼠模型中，Shuto等[14]成功地在大鼠腭突建立種植體周圍炎模型，但也有相關研究表明大鼠腭部種植的成功率低于38.4%，不宜作為種植研究的位點[15]，因此結合文獻筆者認為在大小鼠模型中，上頜第一磨牙具備較多的骨量及較大的操作空間，是較為合適的植入部位。

2.4 建模方案

目前已有多種方法用于在嚙齒類動物模型中誘導種植體周圍炎，其中3種技術使用較廣泛：結扎法、脂多糖注射法及灌喂法。本文就嚙齒類動物種植體周圍炎模型中所用的動物種類、造模干預的方式、拔牙至種植體植入時的時間間隔、種植體植入至開始干預的時間間隔、干預的時間周期進行歸納整理(表1)。并對目前的主流造模方法方式進行總結，歸納出目前嚙齒類動物模型造模流程圖(圖1)。

表1 嚙齒類動物種植體周圍炎模型的建模方案Tab.1 Modeling scheme of peri-implantitis model in rodents

圖1 嚙齒類動物種植體周圍炎模型的構建流程圖Fig.1 Flow chart of peri-implantitis model construction in rodents

2.4.1 結扎法 研究表明無菌鼠僅有局部刺激因素時不會誘導種植體周圍炎的發(fā)生；同樣，普通環(huán)境的常規(guī)小鼠僅有微生物存在而無局部刺激的情況下，也不會誘導炎癥的發(fā)生。因此，誘導種植體周圍炎產(chǎn)生需要同時滿足上述兩個因素[37]。而利用結扎法在種植體周圍進行絲線結扎可以打破種植體周圍黏膜的密封狀態(tài)，產(chǎn)生局部刺激性，同時促進了黏膜下細菌生物膜的形成，繼而引發(fā)炎癥性破壞。結扎法通常在種植體植入并愈合后進行，將5-0/6-0/7-0的絲線結扎在種植固定物頭部，以誘導種植體周圍炎的產(chǎn)生[23]。Nguyen Vo等[21]證明絲線結扎28 d可誘導炎癥反應且伴隨著明顯的種植體周圍骨吸收。也有研究報道絲線結扎14 d即可以誘導小鼠種植體周圍炎的發(fā)生[25]，但是大多數(shù)學者仍然選擇第28天作為一個成熟的結扎模型[21，32-33]。

2.4.2 脂多糖注射法 注射牙齦卟啉單胞菌來源的脂多糖不僅會導致種植體周圍骨丟失，而且會導致種植體周圍軟組織的炎性變化[29]。利用脂多糖注射不需要等待菌斑的聚集及生長過程，加快疾病進程，一般在4周或6周即可建模完成。因此，它特別適合用于測試各種藥物對炎癥的治療效果以及其他疾病因素對炎癥的影響[35，38]。然而該模型的缺點是采用注射方式會對牙周組織造成一定的干擾，使用該模型時需要注意該方式本身帶來的影響。

2.4.3 灌喂法 灌喂法是也是誘導炎癥的一種方法，通過在體外培養(yǎng)外部病原體，如牙齦卟啉單胞菌、連翹坦納氏菌等，并通過灌喂法將其引入大鼠或小鼠的口腔[39]。研究人員對小鼠灌喂6周后成功觀察到口腔感染的發(fā)生[30-31]。與結扎及注射法相比，灌喂法所需要的時間相對增加，一般為6～12周。該技術的操作簡便，技術難度較低，是可選擇的方式之一。

2.4.4 其他構建方法 除了上述三種較為常見的誘導方法外，也有研究者提出多種誘導因素結合的聯(lián)合致病法。有研究報道指出，將浸有牙齦卟啉單胞菌的結扎絲置于小鼠齦下可誘導牙周炎的產(chǎn)生[40]。此方法也被應用于種植體周圍炎小鼠模型的構建，研究人員將浸有牙齦卟啉單胞菌的絲線結扎在種植體周圍，2周后骨吸收顯著增加，提示種植體周圍炎的形成[28]。此外Freire等[41]在種植體植入大鼠口腔之前在鈦植入物上建立了放線菌生物膜，并在植入后第7天和第6周依次觀察到種植體周圍黏膜炎和明顯的種植體周圍骨喪失，證明種植體周圍炎的發(fā)生。其他輔助誘導炎癥手段還包括高糖飲食，如Becker等[42]對小鼠種植體進行結扎后同時輔以高糖飲食成功誘導種植體周圍炎的發(fā)生。李星佳等[43]也對大鼠種植體進行絲線結扎配合糖水喂養(yǎng)，2周后與對照組相比種植體周中性粒細胞與牙齦中的白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)顯著增加且骨組織吸收明顯，提示造模成功。

2.5 造模成功的檢測方法

造模成功的檢測指標主要包括臨床觀察、影像學和組織學三個方面。臨床觀察種植體周圍炎組牙齦組織可見明顯的紅腫、質(zhì)地變軟和滲出并伴有上頜牙齦皺褶丟失或破裂的明顯跡象。牙菌斑在種植體頸緣處積聚，且隨著炎癥進展，出現(xiàn)自發(fā)性出血和軟組織增生[21]。由于種植體周圍炎的主要特征是種植體周骨丟失，因此在影像學方面表現(xiàn)為種植體頂端至牙槽嵴頂距離顯著增加，與炎癥誘導前相比，骨水平顯著下降[44]。在組織學評估方面，也可以觀察到種植體周的骨水平明顯降低，對破骨細胞進行測量和基因表達分析，破骨細胞的存在也證實了種植體周圍出現(xiàn)了骨吸收[20]。同時在結締組織中可以觀察到大量中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，植入物周圍組織的炎癥前細胞因子白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達明顯增加[21]。已知種植體周圍炎會發(fā)生基質(zhì)的降解和促炎細胞因子的轉錄，因此誘導處理后的組織顯示出更多的基質(zhì)金屬蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)染色，也提示種植體周圍炎的存在[22]。

3 嚙齒類種植體周圍炎動物模型的應用

3.1 種植體周圍炎相關分子機制研究

通過建立基因敲除小鼠模型，可以對炎癥過程的相關分子、通路以及相互作用機制進行更深入的探索。有研究者利用Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)基因敲除小鼠驗證了TLR4通過調(diào)節(jié)免疫B細胞的浸潤、核因子κB受體激活劑配體/護骨素(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand/osteoprotegerin，RANKL/OPG)的表達比值和不同炎癥細胞因子的產(chǎn)生，介導結扎誘導的種植周炎小鼠的牙槽骨吸收[28]。Jung等[33]在結扎誘導種植體周圍炎的大鼠模型上，進一步將含p65-轉錄調(diào)節(jié)域(transmembrane domain，TMD)連接的蛋白轉導結構域(protein transduction domain，PTD)的溶液注射入腭部種植體周，證明P65-TMD-PTD抑制了NF-κB的功能，進而減少了大鼠種植體周圍炎部位的炎癥和骨吸收。Mori等[45]研究了在大鼠種植體周圍上皮中的Scgba1、LPO和GBP2基因，這些特征性表達與發(fā)生種植體周圍炎的風險相關。

3.2 種植體周圍炎與牙周炎以及其他系統(tǒng)性全身疾病相關性的探討

種植體周圍炎與牙周炎的關系一直以來受到學者們的熱議[46]。研究人員用嚙齒類動物同時建立了牙周炎以及種植體周圍炎模型，結果表明與牙周炎相比，種植體周圍炎表現(xiàn)出更大的軟硬組織破壞[22]、種植體周圍炎對誘導因素去除后的恢復能力不如牙周炎[19]、抗原誘導的種植體周圍組織破壞比牙周組織破壞發(fā)生得更快[47]。此外，牙周炎與全身系統(tǒng)性疾病的相關性已經(jīng)得到了初步驗證，種植體周圍炎與全身性系統(tǒng)疾病是否相關？在臨床上，已經(jīng)證明高血糖患者種植體周圍炎的發(fā)病率增高[48]，也有學者利用種植體周圍炎動物模型研究口干癥、糖尿病以及血糖波動等其他系統(tǒng)相關性疾病與種植體周圍炎的相關性[20，32，35]。

3.3 種植體周圍炎相關材料的應用研究

Washio等[49]采用細胞片技術在鈦種植體周圍形成了牙周樣結構，提高種植體周圍組織對感染的抵抗力；在研究新材料對種植效果的改善方面也有很多應用，例如在大鼠皮下放置或植入新型材料驗證激光改良型種植體與傳統(tǒng)種植體相比擁有更好的效果[50]、利用大鼠種植體周圍炎模型驗證包裹牙齦間充質(zhì)干細胞(gingival tissue-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)的黏附性水凝膠可以使發(fā)生種植體周圍骨丟失的病態(tài)牙種植體周圍形成完整的骨再生[51]、通過用納米顆粒介導PPARγ基因可產(chǎn)生促進骨整合以及改善種植牙周炎的作用[52]。

4 嚙齒類動物模型的局限性及展望

嚙齒動物模型是探索感染引起的炎癥性疾病發(fā)病機制背后分子機制的重要工具[39]。然而在現(xiàn)有的文獻中，關于種植體周圍炎動物模型的構建方法尚未統(tǒng)一，且有一定的局限性。首先由于結扎誘導技術產(chǎn)生的破壞是一種人為控制的侵入過程，結扎的類型、結扎的位置以及在菌斑形成期間更換結扎的頻率均影響炎癥的發(fā)生與發(fā)展，因此結扎誘導的組織破壞模型并不能作為概括種植體周圍的發(fā)病機制的理想模型[53]。而脂多糖注射法的主要缺點在于它需要在口腔中進行多次注射操作且使用了免疫反應刺激物——脂多糖作為炎癥的誘導劑，與種植體周圍炎的自然發(fā)展過程有一定差距。最后灌喂法雖不需要對植入部位進行任何操作，但在實施過程中需要通過抗生素預處理和多次接種來抑制動物本身存在的內(nèi)源性菌群，以促進人源性致病菌的定植，且當厭氧菌被引入口腔時必須在其不相容的齦上環(huán)境中定植和生存，對模型的構建造成一定挑戰(zhàn)[54]。有研究表明將牙周炎患者的齦下菌斑經(jīng)實驗室處理后涂抹在小鼠牙齒的結扎絲上，可以成功誘導牙周炎，同時使人牙周炎相關細菌有效定植，且菌種更加豐富，更為接近于牙周炎患者口腔環(huán)境[55]。因此筆者認為將此方法應用在種植體上，從而實現(xiàn)動物模型菌群人源化是一種模擬人體種植體周圍炎發(fā)展過程的有效方法。此外致病菌感染時選用多種菌群混合感染或許也可以更好地模擬人類口腔環(huán)境，縮小動物模型與臨床研究的差異。除了造模方法本身的局限性，隨著人群健康的變化，針對不同系統(tǒng)性疾病存在時的種植體周圍炎的研究也對動物模型的構建提出更多要求，因此有必要探索更多存在相關系統(tǒng)性疾病的種植體周圍炎模型。

5 總 結

綜上所述，本文圍繞嚙齒類動物模型在種植體周圍炎研究中的構建方法及應用展開介紹。種植體周圍炎動物模型種類多，建模方案各異。雖然嚙齒類動物模型具有實驗周期較短、費用低、體型小、飼養(yǎng)較易以及相關基因操作及試劑易獲得等其他動物模型不可取代的優(yōu)勢，但它的局限性也十分顯著，如嚙齒類動物微觀和宏觀結構、生長速度與人類存在差異，且體型的限制使實驗對研究人員的操作要求較高。因此，研究者在進行相關實驗時，仍需綜合軟硬條件，合理選擇實驗模型。總之，嚙齒類動物種植周圍炎模型為闡明促進種植周圍炎進展的影響因素提供了有用的工具，而更好地理解種植體周圍炎的發(fā)病機制則有望為新的治療策略指明方向。