蜂蜜抑菌成分與作用機制研究進展

趙歡，王曉澗,3*，賀曉龍,2，毛超，馬鑫，李雪佳

1.延安大學生命科學學院（延安 716000）；2.陜西省區域生物資源保育與利用工程技術研究中心（延安 716000）；3.陜西省紅棗重點實驗室（延安 716000）

作為一種天然食品，蜂蜜中含有200余種化學物質，其中碳水化合物是蜂蜜主要成分，尤其是果糖、葡糖糖等還原性糖，蜂蜜中也含有蛋白質、有機酸、維生素（維生素B6、硫胺、煙酸、核黃素和泛酸）、礦物質（鈣、銅、鐵、鎂、錳、磷、鉀、鈉和鋅）、酚類化合物和多種揮發性化合物[1]。各物質的相互作用使蜂蜜的黏稠度、色澤、風味和顆粒性出現程度性差異，蜂蜜的高營養價值與功能保健特性也使其受到消費者的廣泛關注[2]，因此，蜂蜜在醫療和食品研發領域具有潛在的市場價值和巨大的應用前景。蜂蜜的組分分析與抗菌活性研究是蜂蜜產品高值利用和開發的新方向，綜述該方面研究，對于蜂蜜產品的深入研究和系列抑菌劑的開發具有重要價值。

隨著蜂蜜產品的附加值不斷提高，消費者對蜂蜜制品的需求也逐漸提升，隨著耐藥病原體的快速發展與傳播，藥物抗菌劑的效果逐漸降低，一些微生物對抗菌劑的耐藥性成為公眾健康與抗生素的共同挑戰，在一些具有抗菌活性的天然產物中提取抗菌物質，有利于新型抗菌劑的研發，蜂蜜中含有豐富的抑菌物質，如H2O2、類黃酮、蛋白提取物等[3-4]。綜述蜂蜜中主要化學組分的生物特性與含量變化，如糖類、蛋白質、維生素和礦質元素等，也對蜂蜜中活性物質的抑菌機制，如自由基清除機制、促炎介質調控機制、類黃酮構效機制等進行探究與展望，旨在更新蜂蜜中活性物質的質量參數，為蜂蜜抑菌劑的產業化應用提供理論依據，對蜂蜜制品與蜂蜜提取物的應用具有重大的現實意義。

1 活性成分

糖類是蜂蜜中主要化學成分，占蜂蜜含量的80%以上，蜂蜜的能量、黏度、顆粒性、飽滿度、結晶化、分類鑒定及儲存時間等特性都與糖類物質密切相關。Erban等[5]發現通過測定果糖與葡萄糖（F/G）的比率可以預測蜂蜜的結晶化程度。Kaskoniene等[6]發現果糖與葡萄糖之間的濃度梯度是進行單花蜂蜜分類與鑒別的重要指標。蜂蜜在存儲期間糖類會發生降解反應，戊糖和己糖在緩慢烯醇化的過程中分解，形成呋喃等不良化合物[7]；可將糖降解物作為蜂蜜熱處理和儲存條件的指標。

蜂蜜蛋白質和氨基酸來源于蜜蜂唾液腺和咽部的腺體和花蜜分泌物[8]。蜂蜜中存在很多蛋白酶，如轉化酶、α-和β-葡萄糖苷酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、淀粉酶和葡萄糖氧化酶等[9-10]。淀粉酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶水解α-1, 4-糖苷鍵中的淀粉鏈，產生糊精和低聚糖。β-淀粉酶在末端水解淀粉鏈，導致麥芽糖的形成。蜂蜜中的另一種重要的酶是葡萄糖氧化酶。它將葡萄糖轉化為葡萄糖內酯，水解為葡萄糖酸。除葡萄糖內酯外，葡萄糖氧化酶還產生過氧化氫，具有抗菌作用[11]。氨基酸占蜂蜜成分的1%左右，其相對比率取決于蜂蜜（花蜜或蜜露）的來源。蜂蜜和花粉中最豐富的氨基酸是脯氨酸。脯氨酸主要來源于蜜蜂將花蜜轉化為蜂蜜期間的唾液分泌物。在蜂蜜中，脯氨酸代表50%～85%的氨基酸[12]。

蜂蜜中含有少量維生素，它們主要來自懸浮的花粉粒。蜂蜜中的維生素包括硫胺（維生素B1）、核黃素（維生素B2）、煙酸（維生素B3）、泛酸（維生素B5）、吡哆醇（維生素B6）、生物素（維生素B8或維生素H）和葉酸（維生素B9）。幾乎所有類型的蜂蜜中都存在維生素C，具有顯著的抗氧化、抗衰老和緩解肌肉酸痛的作用，由于蜂蜜的pH較低，蜂蜜中的維生素能夠長時間保存，但是維生素容易受到多種酶促反應和光照、溫度等外界因素的影響，因此在不同條件其含量會發生顯著變化[13-14]。

2 抑菌物質與作用機制

2.1 H2O2

H2O2在蜂蜜的抗菌活性中起著關鍵作用，研究表明H2O2的最低抑制質量濃度（MIC）在10～1 000 μg/mL的范圍內，此外，用CAT處理蜂蜜后，發現抗菌活性明顯降低，也證明H2O2是主要的抗菌劑。蜂蜜中的H2O2濃度在多個水平上進行調節，沒有一種單一的化合物或因素可以控制和預測H2O2的最終量。早期研究表明，可通過蜜蜂GOx的合成速率和過氧化氫酶的分解速率預測H2O2的水平，但是最新證據表明，蜂蜜膠體結構與H2O2密切相關[15]。

Brudzynski等[16]研究不同蜂蜜的膠體結構、抗菌活性和過氧化氫生成之間的關系和過氧化氫生成與深色、中等和淺色蜂蜜相變點之間的關系。相變點代表維持蜂蜜兩相膠體構象所需的紫外線吸收化合物的臨界閾值濃度。由高濃度的蜂蜜紫外線吸收化合物決定的兩相膠體構象促進H2O2的產生，而單相膠體狀態則抑制H2O2的產生。單相稀態構象破壞H2O2分子的穩定性，降低其濃度。通過確定給定蜂蜜中的相變點，可以預測過氧化氫的濃度是否達到最低抑菌濃度。推測膠體顆粒及其周圍區域是一個反應室，允許分子與其他顆粒和周圍糖溶液擴散和交換。盡管有研究表明，蜂蜜中的H2O2抑菌效果與葡糖糖氧化酶的合成與分解速率密切相關，另一部分研究則對該觀點存在質疑，蜂蜜的膠體構象與H2O2的抑菌效果呈“倒U形”關系，蜂蜜的這種構象有利于保持較高的H2O2水平，確保其穩定性，進而保持蜂蜜的抗菌活性，蜂蜜膠體構象將對探究H2O2的生成機理提供新的理論依據。

2.2 蛋白提取物（TPE）

通過親和層析從TPE中獲得5種蛋白質組分，命名為F1、F2、F3、F4和F5，蜂蜜每克含有蛋白質1.75±0.12 mg，F1中含有0.585±0.200 mg/g，F2、F3、F4和F5分別為0.225±0.020，0.291±0.060，0.330±0.030和0.278±0.020 mg/g。所有蛋白質濃度均指蜂蜜的克數。總蛋白提取物（TPE）抑制5種細菌菌株的生長（表3），其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對TPE的敏感性最高，蜂蜜蛋白質組分呈現的廣譜抗菌活性可能是由MRJP（主要蜂王漿蛋白質）和蛋白酶等蛋白質引起的，這些蛋白質可能會破壞并導致細菌膜完整性的喪失[17-19]。

大腸桿菌的MIC范圍為50.0±0.1 μg/mL，銅綠假單胞菌的MIC范圍為200.0±1.0 μg/mL，分別是最敏感和最不敏感的細菌。F1的MIC在抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長方面比TPE低41～50倍（表3）。對于鼠傷寒沙門菌、單核增生李斯特菌和銅綠假單胞菌，相同組分的MIC比TPE低2.6～5倍。革蘭陰性菌（如大腸桿菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門菌）由于其保護肽聚糖層的外膜，對抗生素和抗菌蛋白不太敏感。特別是，具有較高MIC的銅綠假單胞菌表現出比大腸桿菌高100倍的限制性膜通透性，并具有外排泵，這使其更不易受感染，因此可以避免細菌死亡，蜂蜜中蛋白質組分對食源性病原體具有非常好的抗菌活性[20-21]。

表1 蜂蜜中不同蛋白質組分的最低抑菌濃度

2.3 黃酮類物質

蜂蜜中酚類化合物具有抗炎、抗氧化、高效的抑菌活性等作用[22]。這些特性使蜂蜜成為開發新型抗菌藥物的潛在來源。但是這些酚類化合物的劑量和成分因地理分布、季節和植物來源而異[23]。有效的抗菌活性使蜂蜜成為開發新的抗真菌治療策略的潛在來源[24]。

在酚類化合物中黃酮類化合物起主要作用，黃酮類化合物通常被認為是控制慢性炎癥性疾病的天然來源，在傷口愈合方面也有顯著療效，對慢性傷口組織中預先存在的微生物起作用，特別是金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌[25]。黃酮類化合物能夠抑制促炎酶（如COX、LOX、iNOS）和促炎介質（包括一氧化氮、細胞因子和趨化因子）。轉錄因子如NF-κB也受類黃酮調節，此外還控制多種炎癥介質的特異性表達。

黃酮類化合物根據芳香環和雜環的相互作用、雜環的氧化狀態和官能團分為不同亞型[26]。最新的分類包括黃酮醇、黃酮、異黃酮、黃烷醇和黃烷酮（表2）。在過去10年中，含有生物活性化合物的天然食品消費量呈逐年上升趨勢[27]。蜂蜜是酚類化合物種類繁多的食品之一。Bergamo等[28]證實山奈酚和槲皮素比芹菜素和白楊素具有更強的還原鐵（III）和清除ABTS自由基的能力，這與C3位置上存在羥基有關。

表2 蜂蜜中常見的黃酮類物質化學結構及質量參數

2.3.1 自由基清除作用機制

當機體細胞和組織不斷受到生理氧代謝過程中產生的或外源性因素誘導的自由基和活性氧損傷威脅時。活性氧可能導致從炎癥損傷到癌癥的大量疾病[29]。蜂蜜中類黃酮以多種方式發揮抑菌作用，包括螯合參與自由基形成的過渡金屬、直接清除活性氧、抑制產生超氧陰離子的酶及通過減少烷基和過氧自由基防止過氧化過程。王倩等[30]通過鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP）和自由基清除（ABTS）方法評估山奈酚、芹菜素、槲皮素和白楊素的抑菌活性。山奈酚和槲皮素比芹菜素和白楊素具有更強的還原鐵（III）和清除ABTS自由基的能力，這與C3位置上存在羥基有關。Li等[31]則將芹菜素更強的抑菌活性歸因于DPPH和ABTS測定后C4位置上的羥基。在最新用DPPH方法進行的一項研究中，槲皮素的抑菌作用（9 μmol/L抑制率為50%）高于其糖苷（12 μmol/L抑制率為50%）。Ibrahim等[32]研究6種黃酮類化合物作為5-LOX抑制劑的作用，其中2種發現于蜂蜜中。槲皮素和柚皮素在3.7和2.3 μmol/L時分別抑制50%的酶活性。應結合好氧細菌的生活活性，對類黃酮的清除活性氧機制做進一步深入研究，若將其機理用于其他食品的加工儲存過程中，能有助于延緩產品保質期。

2.3.2 促炎介質調節機制

血清蛋白和一些特定細胞（如嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞）從血液遷移到炎癥組織會導致包括炎癥在內的系列疾病發生。類黃酮可能通過降低不同促炎細胞因子/趨化因子的表達發揮作用，包括腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1β）、白細胞介素（IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-8和單核細胞趨化蛋白（MCP-1）。促炎和抗炎細胞因子（如IL-10、IL-4和TGF-β）之間的平衡是疾病進展的關鍵。因此，細胞因子是類黃酮等新型抗炎劑的研究靶點[33]。在抗炎潛力評估期間，優先考慮黃酮類化合物，木犀草素和槲皮素，其次是蘆丁。

類黃酮的抗炎潛力可能與調節促炎基因表達的能力有關，這些基因控制多種介質的產生，如一氧化氮、細胞因子和促炎酶。一些免疫系統因子，包括核因子（NF-κB）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）、叉頭盒P3（FoxP3）、T盒轉錄[34]。蜂蜜中參與炎癥級聯反應的細胞及由細胞產生的控制炎癥過程的介質（損傷后的促炎作用、組織破壞和修復組織的抗炎作用）這一過程為黃酮類化合物抑菌效果反應提供新證據。

2.3.3 類黃酮構效機制

類黃酮通過多種機制發揮其抑菌抗炎作用，在多項研究中，黃酮類化合物的結構與某些炎癥介質的調節之間的關系已建立。花生四烯酸級聯級聯反應的調節酶是炎癥和免疫反應的關鍵。黃酮類化合物可能作為激酶的競爭底物。Middleton等[35]證實槲皮素是1種對三磷酸底物（如ATP和GTP）具有競爭性的抑制劑。木犀草素競爭性地阻斷蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶催化肽上的ATP底物結合位點。糖苷類黃酮和甲氧基對酶抑制效果較差。

磷脂酶A2（PLA2）也是黃酮類化合物靶向的重要炎癥介質。A環和C環的共價性對PLA2抑制起決定性作用[36]。環氧化酶（COX）和脂氧化酶（LOX）更容易被多羥基類黃酮抑制。對于LOX，B環中的兒茶酚基是酶抑制的決定因素[37]。O’Leary等[38]評估黃酮類化合物對COX-2轉錄的活性，并報道槲皮素C3位置上的游離羥基將有助于COX-2抑制，而槲皮素-3-葡萄糖醛酸由于葡萄糖醛酸處于相同位置而效果較差。Raso等[39]也建議將槲皮素和芹菜素作為COX-2抑制劑。Mutoh等[40]評估9種黃酮類化合物對COX-2轉錄的活性，結果顯示B環C3’和C4’位置的游離羥基增加對酶的抑制。Honmore等[41]對黃酮類化合物進行分子對接，表明高良姜素對COX-2具有很高的親和力，因此可以探索作為這種酶的選擇性抑制劑。Choi等[42]通過分子對接，證實白楊素是COX-2的選擇性抑制劑。Lee等[43]闡釋山奈酚抑制激酶的分子機制。Yadavalli等[44]評估對LOX的抑制作用，表兒茶素沒食子酸酯與受試黃酮類化合物（兒茶素、表兒茶素和二氫槲皮素）中的目標酶結合能力最好。

3 結語與展望

利用蜂蜜提取物治療耐藥菌感染具有多種優勢：不易引起病菌耐藥共性、較中藥復方而言，蜂蜜化學組分更明確；蜂蜜中部分物質如H2O2、類黃酮、蛋白提取物等被證實具有較高抑菌活性，且具有較強光譜長效性，抑菌譜廣泛；抑菌機制多樣化，可協同醫藥類抗菌劑，增效對病菌耐藥性的調控；化學穩定性好，提取加工較易且安全無毒；清除自由基、防止過氧化、改善藥物作用靶點，降低促炎和抗炎細胞因子表達。

蜂蜜作為一種天然食品，在功能保健領域具有廣闊應用前景，對蜂蜜的主要化學組分、抑菌活性物質、抑菌機制進行綜述，為利用蜂蜜提取物開發系列安全高效蜂蜜的天然藥物提供理論支撐，為結核病、破傷風、流感、肝炎等相關傳染病的治療途徑提供最新數據幫助，并未合成抗菌藥物耐藥性中的微生物適應問題提供新的研究進展。