asnH過表達對乳酸鏈球菌素發酵的影響

王超，張英華，張杰，李珍愛，李海軍,2,3*

1.山東福瑞達生物科技有限公司（臨沂 276700）；2.山東福瑞達醫藥集團公司（濟南 250101）；3.山東省藥學科學院（濟南 250101）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種陽離子多肽，具有廣泛的抗菌活性，可有效地抑制大多數革蘭氏陽性細菌，對其孢子有強烈的抑制作用且對人體無副作用，因此作為一種安全和天然的防腐劑被廣泛應用于食品工業中[1-2]。Nisin于1969年被糧農組織與世界健康組織（FAO/WHO）確定為安全的食品添加劑，已被50多個國家用作食品防腐劑[3]。但與化學制品相比，由于受控與菌種發酵能力以及企業生產成本的約束，Nisin還未得到更廣泛、充分的應用。

Nisin在酸性（pH 2.0或更低）條件會有更高的活性，但乳酸鏈球菌在中性環境下才能更好地生長和代謝。Nisin在工業生產中，通過添加堿來中和發酵過程中產生的乳酸，然而外界環境pH升高會導致Nisin的降解[4]。許多研究致力于優化Nisin的生產，如改變發酵條件，包括Nisin培養基中的濃度、高乳酸積累、低生物量形成[5-8]、轉移Nisin表型（轉移結合質粒）[9-10]、過表達Nisin生物合成基因集群[11-12]等方面，盡管做了上述很多方面的改進，但乳酸鏈球菌正常生長的pH與最適Nisin的pH的矛盾依舊存在。現在提供一個更合理的通過增強菌株的耐酸性（消耗H+）有效提高Nisin活性的策略，研究利用合成生物學技術來強化asnH基因的表達，能夠提高乳酸鏈球菌的耐酸性以及提高Nisin的產量，為后續的工業化生產提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliDH5α（武漢淼靈生物科技有限公司）；質粒pMG36e（武漢淼靈生物科技有限公司）；Streptococcus lactis（山東福瑞達生物科技有限公司）；同源重組酶購自（Vazyme）。

移液器（德國Eppendorf）；DYY-IOC型電泳儀（北京六一儀器廠）；FM70雪花制冰機（北京長流科學儀器公司）；Osterode臺式高速冷凍離心機（BIOFUGE）；Sorvall RC-6型高速冷凍離心機（Thermo Fisher）；梯度PCR儀（德國Eppendorf AG）；實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Quant-StudioTM3）；pH計（METTLER TOLEDO FE28-standard）；超凈工作臺（智誠超凈工作臺ZHJHC1112C）；電轉化儀（BIO-RAD MicroPulserTM）；Gel DocTMXR+凝膠成像儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pMG36e-asnH的構建與表達

1.2.1.1 細菌菌株，質粒和生長條件

研究中使用的菌株和質粒除非另有說明，否則乳酸鏈球菌在30 ℃的種子培養基中生長，大腸桿菌生長在LB培養基中于37 ℃培養，紅霉素對于大腸桿菌為800 μg/mL，對于乳酸鏈球菌為200 μg/mL。種子培養基（wt/vol）的準備：酵母提取物（1.5%），蛋白胨（1.5%），KH2PO4（2.0%），蔗糖（2.0%），NaCl（0.15%）和MgSO4·7H2O（0.015%），pH 7.0。乳酸在酸脅迫試驗中調節的酸脅迫培養基（pH 7.0，6.0，5.0和4.0）僅用蛋白胨（2%）和氯化鈉（0.1%）。Nisin中瓊脂擴散生物測定的培養基（wt/vol）活性測定方法：胰蛋白（0.8%），酵母提取物（0.25%），葡萄糖（0.5%），Na2HPO4（0.2%），NaCl（0.5%）和瓊脂粉（1.5%）。

1.2.1.2 重組質粒pMG36e-asnH的構建

根據GenBank報道的asnH的基因序列在結合pMG36e表達載體的開放閱讀框，在多克隆位點處的酶切位點進行引物設計，上游引物asnH-F：5’-TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATGTGTGGAATTGTCGGCTTTAT-3’，下游引物asnH-R：5’-TGCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAAAAATTAACCACAGCAGGTTTTT-3’。擴增程序：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，1 min；30個循環；72 ℃，5 min。

1.2.1.3 熒光定量PCR技術

對于實時qPCR分析，使用Primer Express 5.0軟件設計了基因特異性引物（a和b）。用于qRT-PCR的寡核苷酸：a，5’-TTCTTCTCGCAAAACCAGTC-3’；b，5’-GCATACAGCGGAACAAAT-3’。分別提取不同pH發酵培養基（pH 7.0，6.0，5.0和4.0）中的乳酸鏈球菌的RNA進行RT-qPCR。PCR的參數：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；50 ℃，10 s；72 ℃，20 s；55個循環；72 ℃，5 min。

1.2.2 耐酸測試

菌株在50 mL種子培養基中30 ℃下生長靜置培養8 h。然后通過以8 000g離心收集細胞，用0.9% NaCl洗滌2次，重懸于50 mL酸性壓力培養基（pH 7.0，6.0，5.0和4.0）靜置培養3 h。用生理鹽水在1.5 mL離心管中進行梯度稀釋，充分混勻，然后將它們分別涂布于固體平板中，在30 ℃恒溫培養箱中，統計各個平板上菌落數。

1.2.3 乳酸鏈球菌素效價的測定參見食品安全國家標準GB 1886.231—2016《食品添加劑 乳酸鏈球菌素》[13]。

1.2.4 發酵培養基培養方法

1.2.4.1 碳源對Nisin效價的影響

將FRH種子培養液5%的接種量分別接種于含20 g/L的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉及果糖作為唯一碳源的液體發酵培養基（50 mL/250 mL）中，其他各成分不變，于30 ℃靜置培養18 h。依次取培養Nisin發酵效價。

1.2.4.2 氮源對Nisin效價的影響

將FRH種子培養液5%的接種量分別接種于含15 g/L的不同比例的酵母粉、牛肉膏和玉米漿粉為氮源的液體發酵培養基（50 mL/50 mL）中，其他各成分不變，于30 ℃靜置培養18 h。依次取培養Nisin發酵效價。

1.2.4.3 磷酸鹽對Nisin效價的影響

以選出的培養基組分為基礎，在保持其他組分不變的條件下，只調整其中的磷酸鹽，配制成新的發酵培養基，研究考察Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4對FRH產Nisin效價的影響。選擇質量濃度5，10，15，20，25和30 g/L，對最佳磷酸鹽的添加量進行考察優化。

1.2.4.4 Mg2+對Nisin效價的影響

Mg2+以MgSO4的形式加到培養基中，Mg2+質量濃度設為0.01，0.02，0.03，0.05，0.06和0.1 g/L，考察Mg2+對FRH重組菌生產Nisin的影響。

1.2.5 Box-Behnken研究設計

響應面法（response surface methodology，RSM）以回歸方程作為函數估算工具，在多因子試驗中，將響應值（因變量）與因子（自變量）之間的相互關系用二階多項式擬合，實現兩者關系的函數化，將其交互作用進行優化與評價來確定生物過程的最佳培養條件[14]。研究選取對構建的FRH菌株產Nisin會有影響的3個關鍵因子玉米漿濃度、蔗糖濃度、KH2PO4濃度等進行試驗設計。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pMG36e-asnH的構建與表達

2.1.1 重組質粒pMG36e-asnH的構建

以乳酸鏈球菌基因組為模板，進行PCR擴增并進行測序，結果如圖1（A）所示。連接片段大小為1 874 bp，登錄GenBank比對片段與L.lactisasnH的同源性，結果為100%，確定該片段為asnH的基因序列。通過同源重組的方法進行連接，挑取單克隆進行PCR驗證，通過酶切驗證（圖1 B）及DNA測序證實。通過電穿孔轉化的方法得到pMG36e-asnH（FRH）重組菌株。

圖1 重組質粒pMG36e-asnH的構建

2.1.2 熒光定量PCR技術

對原始菌株與FRH菌株中的asnH基因進行RTPCR，結果如圖2所示。asnH基因在重組菌中6，9，12 h的表達量均顯著高于原始菌株，表達量分別提高0.12，1.26和2.39倍，說明asnH基因的導入明顯促進了asnH基因的過量表達。

圖2 原始菌（CK）和重組菌（FRH）的asnH在不同時間的表達量

2.2 耐酸測試

在Nisin生產過程中，酸脅迫已被證明是一種主要的限制性因素。如圖3所示，隨著pH的降低，酸性增強，野生菌株和FRH菌株的存活率都會發生一定程度的下降，但是在pH 4.0的條件下FRH菌株的存活率明顯的高于對照菌株，達到2.5倍。結果表明，過表達asnH使乳酸鏈球菌在應對極端酸性環境方面起到了較為顯著的調節作用。

圖3 原始菌（CK）和重組菌（FRH）在不同pH下的存活率

2.3 乳酸鏈球菌素效價的測定

乳酸鏈球菌素效價的測定參照GB 1886.231—2016《食品添加劑 乳酸鏈球菌素》[13]。

2.4 發酵培養基培養方法

2.4.1 碳源對Nisin效價的影響

圖4顯示，在發酵培養基中碳含量相同的情況下，碳源為蔗糖時FRH菌株發酵產Nisin效價最高，達到6 359 IU/mL，蔗糖可以作為FRH發酵產Nisin的最適碳源。

圖4 碳源對Nisin效價的影響

2.4.2 氮源對Nisin效價的影響

圖5顯示，在發酵培養基中復合氮源按照不同比例添加，氮源組分按照酵母粉、牛肉膏、玉米漿粉質量比1∶1∶2，即酵母粉、牛肉膏、玉米漿粉的含量分別為5，5和10 g/L時，FRH菌株的發酵產Nisin效價最高，達到6 859 IU/mL。

圖5 氮源對Nisin效價的影響

2.4.3 磷酸鹽對Nisin效價的影響

圖6（A）顯示，比較6種不同的磷酸鹽對FRH發酵產Nisin效價的影響，培養基中最優磷酸鹽為KH2PO4。研究不同濃度KH2PO4對Nisin發酵效價的影響，結果如圖6（B）所示。開始時Nisin效價隨著KH2PO4濃度的增加而升高，當KH2PO4添加量達到15 g/L后，繼續添加KH2PO4，Nisin效價不再提高，KH2PO4添加量15 g/L時FRH重組菌發酵產Nisin效價為7 198 IU/mL。

圖6 磷酸鹽對Nisin效價的影響

2.4.4 Mg2+對Nisin效價的影響

圖7顯示：發酵培養基中Mg2+添加量在0～0.02 g/L的范圍時，Nisin效價增加較為明顯；Mg2+添加量范圍為0.02～0.05 g/L時，Nisin效價基本保持不變；Mg2+添加量大于0.05 g/L，Nisin效價反而下降。發酵培養基Mg2+的最適添加量為0.02 g/L，Nisin的效價為7 216 IU/mL。

圖7 不同Mg2+對Nisin效價的影響

2.5 Box-Behnken研究設計

Box-Behnken試驗因素及水平編碼見表1，結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平編碼

表2 Box-Behnken因素水平研究設計及結果

從表3的數據利用Design-Expert軟件擬合得到多元回歸模型：Y=7 013.10+81.80X1+317.50X2+394.00X3-106.00X1X2+143.50X1X3+68.25X2X3+58.58X12-314.92X22-391.42X32，其中X1、X2、X3分別代表玉米漿、蔗糖、K2HPO4編碼水平。可以看出，模型P值達到0.005 6（P＜0.05），其顯著性大于95%，同時失擬項P值為0.088 1（P＞0.05），不顯著，說明模型的回歸性良好，這些結果反映了設計的Box-Behnken試驗能夠較好地模擬出真實試驗進行的發酵培養基最佳組合的情況預測。

表3 回歸模型方差分析

3 結論與討論

Nisin的產生與生物質密切相關，細胞生長遲緩會降低細胞生物量并限制Nisin的產生。研究表明酸相關模塊的過度表達通過增強抗酸能力確保了Nisin的收獲[15-16]。微生物在酸性環境中的生存主要取決于其廣泛的耐酸機制，通過改變緩沖能力來改善細胞內pH（pHi），這個過程是通過質子動力（PMF）泵出質子，通過刺激堿消耗質子排出[17]或通過改變細胞膜成分[18]，從而保護細胞免受酸損傷，pHi穩態這個過程伴隨著受損蛋白質/DNA的修復[19-20]。此次試驗采用基因工程技術構建重組質粒PMG36e-asnH，經電轉化轉至乳酸鏈球菌中得到1株穩定高產Nisin的重組菌FRH，實時熒光定量 PCR技術確定asnH基因過量表達，增加的D-Asp酰胺化水平可以提高乳酸鏈球菌抵抗酸脅迫的能力，通過這種方法，菌株能夠避免細胞裂解并在酸性環境中頑強生長。

通過單因素研究和響應面法優化重組菌的發酵培養基組分，結果表明重組菌株FRH在優化后的培養基的發酵水平比原始菌提高了27.2%。研究為Nisin的發酵菌種改造提供新的研究方法以及為發酵生產提供參考。