宋河大曲放線菌的分離鑒定及其混菌作用

苑建偉，崔夢嬌，侯小歌，梁晨晨

1.周口職業技術學院農牧工程學院（周口 466000）；2.周口師范學院生命科學與農學學院（周口 466000）

放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強大的原核生物，其代表屬有鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、放線菌屬等[1]，被廣泛應用于抗生素、各種酶制劑、有機酸和維生素等的生產，同時也應用于烴類發酵、石油脫蠟和污水處理等方面，但有些放線菌會對人類構成危害[2]。

大曲作為中國濃香型白酒的主要糖化發酵劑，富含酵母菌、細菌、霉菌和放線菌，放線菌作為白酒釀造微生物中的一類，在培曲和糟醅發酵過程中可產生纖維素酶，破壞谷物細胞壁，利于淀粉釋放，提高淀粉的利用率[3]。同時大多放線菌可產生大量次級代謝產物，尤其是抗生素，對多種菌種均有抑制作用，因此大曲中放線菌的種群結構和功能特性直接影響大曲的質量，進而影響濃香型白酒的產量和品質[4]。近年來，對白酒釀造過程中放線菌的研究主要集中在其對白酒風味的影響及發酵過程中對其他菌群的抑制作用[5-6]。

宋河白酒作為豫東地區的典型代表，對其釀酒微生物的研究已有不少報道，但是對白酒中放線菌的研究較少。以宋河大曲為原料，對放線菌進行分離鑒定，并對其中典型的放線菌與宋河大曲其他主要菌株的相互作用進行初步探索，以期對改善白酒風味、放線菌的利用與開發提供方法和理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高氏一號培養基[7]、糖發酵基礎培養基[8]、淀粉培養基[9]、明膠培養基[10]、硝酸鹽培養基[11]、指示紅曲霉菌培養基[12]、指示酵母菌培養基[13]、指示芽孢菌培養基[14]（所有培養基經121 ℃、0.1 MPa高溫高壓滅菌20 min待用）。

電子天平（型號AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產；超凈工作臺（型號JJ-CJ-2FD），蘇州市金凈凈化設備科技有限公司生產；恒溫培養箱（型號DHP-9162），上海一恒科學儀器有限公司生產；滅菌鍋（型號SYQ-PSX-280B），上海申安醫療器械廠生產；可見分光光度計（型號V-5000），上海元析儀器有限公司生產；等。

1.2 放線菌的分離

將大曲粉碎，在無菌條件下取10 g粉碎樣品加入90 mL無菌水，搖床振蕩30 min后靜置，做梯度稀釋。取10-2，10-3和10-4梯度進行涂布平板，于30 ℃倒置培養5～7 d，在高氏一號培養基中篩選數量優勢放線菌和具有明顯特征的放線菌單菌落分別純化后低溫保藏備用[15]。

1.3 放線菌形態學和生理生化特性鑒定

1.3.1 形態學觀察

主要包括菌落特征和濕室培養的顯微鏡細胞觀察[16]。

1.3.2 生理生化特性試驗

1.3.2.1 過氧化氫酶試驗

將放線菌接種于基礎培養基上于28 ℃培養5 d。取清潔的載玻片，在載玻片上滴1滴3% H2O2，挑取1環菌絲，在H2O2溶液中涂抹，5 min內觀察是否有氣泡產生[17]。

1.3.2.2 耐鹽試驗

在高氏一號培養基中分別加入3%，5%和8% NaCl配制成耐鹽培養基，將待測菌絲接種到耐鹽培養基上，28 ℃培養7 d，以未添加NaCl的高氏一號培養基為對照，觀察放線菌生長情況[17]。

1.3.2.3 生長溫度試驗

將分離得到的放線菌各接種4個平板，分別在30，34，37和42 ℃條件下培養7 d，觀察對比放線菌的生長情況[17]。

1.3.2.4 硝酸鹽還原試驗

將1環菌絲接種于還原硝酸鹽培養基中，在30 ℃培養7 d后，分別加入硝酸鹽還原試劑甲液和乙液各2滴[17]。

1.3.2.5 淀粉水解試驗

用點種法將菌種接種在淀粉瓊脂培養皿上，于30℃培養7 d，在菌落周圍滴加1～2滴碘液，觀察試驗現象[17]。

1.3.2.6 明膠液化試驗

在高氏一號培養基中加入1%明膠，傾注平板。將平板分區分別點種，培養5 d，在菌落上滴加Frazier試劑，10～20 min后觀察菌體周圍是否出現透明圈[17]。

1.3.2.7 糖發酵試驗

制備果糖、葡萄糖、麥芽糖液體培養基，分裝到不同的試管中，將1環放線菌接種到3種液體培養基中，并在試管內放入杜氏小管，在30 ℃培養5～7 d，觀察液體是否變紅，杜氏小管中是否有氣泡，確定放線菌對糖醇的利用情況[17]。

1.3.2.8 Voges Proskauer（VP）試驗

吸取2滴0.5%肌酸溶液注入潔凈小試管中，取1環放線菌菌絲接種。加入3滴5%α-萘酚，2滴40% KOH溶液，振蕩后放置5 min，觀察顏色是否變化[17]。

1.4 典型混菌作用研究

1.4.1 放線菌對大曲酒曲優勢菌生長的抑制作用

制備放線菌菌懸液，使用不含瓊脂的高氏一號培養基按5%接種量接種放線菌，在28 ℃條件下，搖床培養7～10 d。

分別挑取大曲數量優勢芽孢菌Sp1、Spm1、Spm2，耐高溫酵母菌Y1、Y2，以及10環紅曲霉菌菌苔，加入到20 mL無菌水中，搖勻，制備菌懸液，依次按10倍梯度稀釋。取1 mL合適稀釋度的菌懸液涂布在酵母菌指示平板上，分別做好標記。用鑷子夾住直徑約1 cm的無菌圓濾紙片，蘸取少許放線菌發酵液，貼到有各指示菌平板上，每個平板上貼3～4片，在30 ℃條件下培養3 d，觀察是否出現抑菌圈，如果出現抑菌圈，精確測量各個抑制圈直徑（R/cm），并計算抑制圈直徑與濾紙片的直徑（r/cm）的差值（R-r/cm）。通過比較差值大小，分析放線菌典型抑菌活性。

1.4.2 放線菌對大曲典型菌株的混合發酵作用

分別挑取10環芽孢菌、酵母菌、紅曲霉菌，加入到20 mL無菌水中，搖勻，制備菌懸液，依次10倍梯度稀釋。按2%接種量，分別將芽孢菌Sp1、Spm1、Spm2，酵母菌Y1、Y2及紅曲霉菌這6種菌的種子液接入液態基本培養基中，按接種量1%接入放線菌。未接種放線菌的為空白對照，做2組平行試驗，在28 ℃條件下搖床培養5～7 d。

采用分光光度和標準曲線法測定淀粉酶活力，采用蒸餾法和酒精計測定法測定其產酒力，采用滴定法測定酯化酶活力[18]。

2 結果與分析

2.1 放線菌的分離鑒定

從宋河高溫大曲中共分離純化到5株放線菌，分別編號為F1、F2、F3、FM、Fh，菌株的典型菌落特征和鏡檢特征如圖1所示。

圖1 放線菌的菌落特征和鏡檢特征

分離得到的各種放線菌的生理生化特性如表1所示。放線菌F1、F2、F3、Fh、FM均能利用葡萄糖、麥芽糖和果糖，明膠液化及VP試驗均為陽性，均不能使硝酸鹽還原；F2、Fh含有過氧化氫酶，F1、F3、FM不含過氧化氫酶；F1、F2能使淀粉水解，F3、Fh、FM不能使淀粉水解。根據溫度生長情況可知：F1、F2、F3、FM為中溫菌，Fh為中高溫菌；F1、F2耐鹽性較強，F3耐鹽性一般，FM、Fh耐鹽性較弱。

綜合圖1和表1可知：菌株F1、F3、Fh、FM這4株放線菌形態基本上相同，生理生化特征也基本相似，參照《微生物分類學》《鏈霉葛鑒定手冊》[19-20]，F1、F3、Fh、FM這4株放線菌基本上都符合放線菌鏈霉菌屬的特征，F2基本符合放線菌擬諾卡菌屬的特征，故初步鑒定放線菌F1、F3、Fh、FM為鏈霉菌屬，F2為擬諾卡菌屬。

表1 放線菌的生理生化特性

2.2 放線菌與大曲典型菌株的混菌作用

2.2.1 放線菌對大曲典型菌株生長的抑制作用

放線菌F1對大曲3類典型菌株的抑菌情況如表2所示。菌株F1對酵母菌Y1、Y2的生長抑制作用較大，對芽孢菌Spm1、Spm2的抑菌作用較小，對芽孢菌Sp1、紅曲霉菌沒有抑制作用。由此可知，放線菌F1并不影響芽孢菌Sp1、紅曲霉菌的生長，但不能與酵母菌Y1、Y2混合生長，在糟醅發酵過程中不利于產酒。

表2 菌株F1抑菌情況 單位：cm

放線菌F2的抑菌情況如表3所示。菌株F2對芽孢菌Spm2的生長有抑菌作用，對其他2株芽孢菌沒有抑菌作用，對酵母菌Y1、Y2的生長也有抑菌作用，對紅曲霉菌的生長沒有抑菌作用。由此可知，放線菌F2對部分芽孢菌生長有抑制，對酵母菌抑制能力低于放線菌株F1，在白酒生產上可以加以利用。

表3 菌株F2抑菌情況 單位：cm

放線菌F3的抑菌情況如表4所示。菌株F3對酵母菌Y2生長抑制作用非常明顯，對酵母菌Y1、芽孢菌Spm2也有抑制作用，對其他菌株沒有抑制作用。由此可知，菌株F3對酵母菌抑制作用強，不利于白酒生產。

表4 菌株F3抑菌情況 單位：cm

菌株FM的抑菌情況如表5所示。放線菌FM對所有菌都有抑制作用，對紅曲霉菌的抑制作用最強，對其他菌株的生長也有不同程度的抑制作用，不利于培曲和糟醅發酵。

表5 菌株FM抑菌情況 單位：cm

菌株Fh的抑菌情況如表6所示。菌株Fh對酵母菌Y2、Y1和芽孢菌Spm1、Spm2也有抑制作用，對芽孢菌Sp1、紅曲霉菌并沒有抑制作用。

表6 菌株Fh抑菌情況 單位：cm

在大曲培養和糟醅發酵過程中，放線菌與其他菌株混雜生長，芽孢菌Sp1和紅曲霉菌分別作為大曲數量優勢菌和重要的功能性菌株，除放線菌株FM外，其他放線菌并不影響其生長，但5株放線菌均能抑制酵母菌的生長，因此放線菌對制曲影響不大，但不利于糟醅發酵。

2.2.2 放線菌與大曲典型菌株的液態發酵作用

2.2.2.1 放線菌對優勢芽孢菌產淀粉酶能力的影響

由表7可知：除放線菌Fh使芽孢菌Sp1，放線菌F2、F3、Fh使芽孢菌Spm1產淀粉酶能力增強外，其余放線菌對芽孢菌的產酶能力的影響均表現為抑制，但是抑制效果并不明顯，所以在液體發酵過程中放線菌對芽孢菌的產淀粉酶能力并不明顯，并且可以利用放線菌Fh提高芽孢菌Sp1的產淀粉酶能力。

圖2 淀粉標準曲線圖

表7 放線菌對芽孢菌產淀粉酶能力的影響單位：U/mL

2.2.2.2 放線菌對大曲紅曲霉菌產酯化酶能力的影響由表8可知：放線菌F1使紅曲霉菌的產酯化酶能力升高，菌株F2、Fh和FM使紅曲霉菌產酯化酶能力降低，但并不明顯，菌株F3對紅曲霉產酯化酶能力沒有影響。由此可知，在白酒生產過程中合理利用菌株F3能使紅曲霉菌產酯化酶能力提高，達到提高白酒品質的目的。

表8 放線菌對酒曲優勢紅曲霉菌產酯化酶能力的影響單位：U/mL

3 結論

通過以宋河大曲為試驗材料分離放線菌并對其進行初步鑒定，分離得到5種放線菌F1、F2、F3、Fh、FM，其中F1、F3、Fh、FM為放線菌鏈霉菌屬，F2為擬諾卡氏菌屬。

分別采用抑菌片法和液態發酵法考察放線菌對大曲優勢菌生長抑制和相互作用，5株放線菌均抑制大曲酵母菌的生長但并不抑制其產酒力，除放線菌株FM外，其他4株不抑制大曲優勢芽孢菌Sp1和紅曲霉的生長，5株放線菌均不同程度地抑制芽孢菌Spm1和Spm2的生長和產淀粉酶能力，但影響并不大。放線菌F1使紅曲霉菌的產酯化酶能力升高，其余4株并不影響其產酶。