基于Illumina MiSeq分析3種市售茶葉中的微生物結構

范三紅，薛騰達，白寶清，薛虎貴，藺佳鈺，張錦華*

1.山西大學生命科學學院（太原 030006）；2.特色植物資源研究與利用山西重點實驗室，山西大學（太原 030006）

茶作為世界三大飲料之一[1]，根據不同的發酵工藝可以分為不發酵茶、半發酵茶、全發酵茶和后發酵茶[2-3]。白茶、紅茶、生茶是市場上較為常見的三種茶葉。白茶不經殺青或揉捻，只經過萎凋、干燥后加工而成[4]。紅茶經萎凋、揉捻（切）、發酵、干燥加工而成，屬全發酵茶[5]。生茶是直接曬青（殺青、揉捻日曬）后經蒸壓而成[6]，未經過渥堆發酵。現有研究發現：茶葉的加工工藝對其中的微生物群落結構組成有驅動作用[7]，且微生物會參與茶葉中活性成分的代謝與轉化[8]，因此研究茶葉加工過程及儲存出售等階段微生物的組成有一定意義。

隨著變性凝膠電泳（PCR-DGGE）[9]、焦磷酸測序[10]、元基因組學[11]等多種生物技術手段的出現，大量研究著重于檢測茶葉加工過程中的微生物結構[12-13]，研究茶葉功能成分與微生物之間的相關性[14-15]以及從代謝組學的角度研究茶中的微生物相互作用[8,16]，而對于茶葉在市售及儲藏過程中的研究主要集中于不同倉儲年份茶葉理化成分[17-19]以及茶葉儲存條件[20]的研究。普洱茶發酵微生物溯源分析發現茶葉內生細菌是普洱茶發酵微生物的重要來源[21]。同時，茶葉內生菌和根際細菌也是茶葉生防菌的重要來源[22-23]。茶葉在儲藏中微生物組成與茶葉衛生安全問題密切相關，但目前針對茶葉在銷售過程中微生物群落結構的研究較少，尤其是針對紅茶和生茶中微生物群落結構的研究。針對不同加工工藝制作的茶葉中微生物結構差異的研究不多；對于茶葉保藏中微生物的變化及微生物對茶葉品質影響的研究不足。研究利用高通量測序技術對3種不同類型的市售茶葉中的微生物群落多樣性進行分析，以期對后續茶葉出售及儲存過程中微生物安全性及對品質的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：市售的生產日期為2020年3月的白茶（BC）、紅茶（HC）及2011年3月的生茶（SC），2021年7月購買自中國云南省雙江勐庫蘊品茶廠，購買后原包裝常溫干燥保存于實驗室。

試劑：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，天津博迪化工股份有限公司）。

儀器：YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）；MX-S渦旋混合儀（北京佳航博創科技有限公司）；S.SW-CJ-1FD型凈化工作臺（上海躍進醫療器械有限公司）；H2100R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SC-3614低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

參考王雪山[24]富集微生物的方法，對3種茶葉樣品進行預處理。

1.2.2 PCR擴增及測序

預處理后的樣品送往北京諾禾致源股份有限公司，采用CTAB法提取樣品基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測 DNA 的純度和濃度，將合格的DNA樣品作為模板，利用通用引物515F（5＇-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3＇）/806R（5＇-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3＇）對細菌16SrDNAV3-V4區進行擴增，利用1737F（5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇）/2043R（5＇-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3＇）對真菌ITS1區進行擴增。PCR擴增體系30 μL，PCR擴增程序：98 ℃預變性1 min，98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，72 ℃ 5 min，循環30次。

擴增結束后使用2%濃度的瓊脂糖凝膠PCR產物進行檢測，上樣時目標片段標準品5 μL（10 ng/μL），DNA marker 2 μL，PCR產物5 μL；之后對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。之后使用Nova Seq 6000平臺進行高通量測序。

1.3 數據處理

對Illumina NovaSeq測序得到數據進行處理，以97%的一致性和OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類進行物種注釋及豐度分析；通過α多樣性（Alpha Diversity）揭示出樣本中物種組成和樣本間群落結構的差異；利用主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）[25]揭示三種茶葉樣品的相似性。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物電泳圖

PCR產物電泳圖如圖1所示，目的條帶大小正確且明亮，滿足測序需要。

圖1 PCR產物電泳圖

2.2 OTU聚類分析

如圖2所示：3種茶葉中共檢測到403個細菌OTU數，不同樣品的OTU數中BC（256）＞HC（115）＞SH（64），共有的細菌OTU數為56個，BC、HC、SC特有的OTU數分別為200，59和8個。三種茶葉中共檢測到717個真菌OTU數，不同樣品的OTU數中BC（406）＞HC（405）＞SH（186），共有的細菌OTU數為140個，BC、HC、SC特有的OTU數分別為266，265和46個。綜上可知，三種茶葉中真菌的OUT數大于細菌，說明茶葉中真菌種類多于細菌。其次，BC中OTU數最多，HC次之，生茶最少，可能原因在于：白茶未經殺青和發酵，保留了茶葉本身多的大多數微生物，使其具有最多的OTU數；紅茶未經殺青，經發酵后一部分微生物死亡，使其OTU數低于白茶；生茶經殺青，殺死了茶葉中的一部分微生物，使生茶的OTU數最少。

圖2 OTU venn分析

2.3 Alpha Diversity分析

Alpha Diversity用于分析樣本內（Within-community）的微生物群落豐富度和多樣性[26]，結果見表1。三種茶葉樣本中細菌和真菌的Goods-coverage為1.00，說明測序深度符合樣品中微生物多樣性分析要求。通過比較三種茶葉樣品的細菌與真菌多樣性指數大小關系發現，細菌與真菌相同，Shannon指數、Chao1指數、ACE指數大小均為BC＞HC＞SC，說明白茶中微生物群落多樣性最高，生茶最低；HC的Simpson指數最高，說明紅茶經發酵后中微生物群落分布均勻，白茶未經發酵，其微生物多樣性最高，但均勻度較低于紅茶。

表1 Alpha多樣性指數統計表

2.4 不同茶葉細菌群落組成分析

2.4.1 基于門水平和綱水平下細菌群落組成

在門分類水平下共鑒定到22個細菌門，相對豐度前10的結果如圖3（A）所示，藍藻門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）是三種茶中的優勢細菌菌門，其他細菌菌門相對豐度均小于1%。白茶中藍藻門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的占比為53%和43%，但與陳佳佳等[27]研究的儲藏白茶相比，此次試驗藍藻門相對豐度較高，其他細菌菌門基本一致。紅茶中變形菌門（Proteobacteria）為主要的優勢菌門，占比為61%，藍藻門（Cyanobacteria）占比為36%。生茶中藍藻門占比為94%，變形菌門（Proteobacteria）占比6%。

圖3 門水平（A）、綱水平（B）下三種茶葉中細菌的相對豐度

在綱分類水平下共鑒定到43個細菌綱，相對豐度前10的結果如圖3（B）所示，白茶中Cyanobacteriia、丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、桿菌綱（Bacilli）分別占比53%，32%，10%和2%。紅茶中Cyanobacteriia、丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）分別占比36%，56%和5%。生茶中Cyanobacteriia、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）分別占比94%和5%。其他菌綱占比均小于1%。

2.4.2 基于屬水平下細菌群落組成

在屬分類水平下，共鑒定出194個細菌菌屬，選取屬水平排名前10的優勢菌屬進行相對豐度計算，結果如圖4所示。將不能鑒定到屬水平的序列歸并為unclassfield，將其他菌屬歸并為others。除未分類的unclassfiel_Chloroplast及unidentified_Mitochondria，白茶中優勢細菌菌屬為泛生菌屬（pantoea），占比為21%，其次鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium-Methylorubrum）占比分別為4%和3%，在陳佳佳等[27]的研究中也是白茶中的優勢菌屬。紅茶中泛生菌屬（pantoea）占比為1%，乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、短桿菌屬（Brevibacteriumsp.）、魏斯氏菌屬（Weissella）等乳酸菌在紅茶樣品中也有檢出，但相對豐度很低。生茶中細菌菌落占比較低，unclassfiel_Chloroplast占比為94%。由此可知，紅茶和生茶中細菌相對豐度低于白茶。

圖4 屬水平下三種茶葉中細菌的相對豐度

2.5 不同茶葉真菌群落組成分析

2.5.1 基于門水平和綱水平下真菌群落組成

在門分類水平下共鑒定出6個真菌門，如圖5（A）所示，子囊菌門（Ascomycota）是3種樣品中主要的真菌菌門，分別占總數的90%，90%和50%，擔子菌門（Basidiomycota）在白茶和紅茶中的含量為4%，在生茶中含量低于1%。

在綱分類水平下共鑒定出29個真菌綱，如圖5（B）所示。白茶中座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）為優勢菌綱，相對豐度為59%和30%，銀耳綱（Tremellomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）占比分別為2%和1%。紅茶中糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）為優勢菌綱，相對豐度為38%，34%和13%，酵母綱（Saccharomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）占比分別為5%，2%和1%。生茶中糞殼菌綱（Sordariomycetes）為優勢菌綱，相對豐度為42%，散囊菌綱（Eurotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）占比分別為7%和1%。其他菌綱占比均小于1%。

圖5 門水平（A）、綱水平（B）下三種茶葉中真菌的相對豐度

2.5.2 基于屬水平下真菌群落組成

在屬分類水平下共有418個真菌菌屬，結果如圖6所示。在3種樣品中真菌群落結構差異較大。白茶中的優勢菌屬為枝孢菌屬（Cladosporium）、帚枝霉屬（Sarocladium），相對豐度分別為43%和25%。紅茶樣品中優勢菌屬為籃狀菌屬（Talaromyces）、Gloeotinia屬、枝孢菌屬（Cladosporium）、帚枝霉屬（Sarocladium），相對豐度為33%，31%，8%和5%。生茶中優勢真菌菌屬Gloeotinia屬相對豐度為33%，帚枝霉屬（Sarocladium）和曲霉屬（Aspergillus）的相對豐度均為7%。曲霉屬在茶葉發酵與儲藏市售過程中均存在；枝孢菌屬常見于死掉的作物上的霉菌，屬腐生生物；帚枝霉屬是一種可抑制土傳植物病原菌的真菌，在茶葉上主要起抑菌、溶菌的作用；Gloeotinia屬是一種生防真菌。

圖6 屬水平下三種茶葉中真菌的相對豐度

2.6 PCA主成分分析

對3種芽菜中的微生物菌群進行主成分分析，結果見圖7。細菌群落中第一主成分貢獻率為70.77%，第二主成分貢獻率為29.23%，累計貢獻率為100%。真菌群落中第一主成分貢獻率為55.88%，第二主成分貢獻率為44.12%，累計貢獻率為100%。無論細菌還是真菌，3種茶葉樣本之間的距離較遠，說明3種茶葉中的微生物群落結構有較大的差異。

圖7 PCA分析

3 結論

利用高通量測序技術分析了3種市售茶葉中微生物群落結構，3種不同工藝不同生產年份的茶葉中微生物的多樣性豐富程度具有顯著差異，其中白茶微生物多樣性最為豐富，其次是紅茶和生茶。不同茶葉體現出不同的微生物群落結構。在門水平下，藍藻門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）是3種茶中的優勢細菌菌門，子囊菌門（Ascomycota）是優勢真菌菌門。在屬水平下，3種茶葉中主要優勢細菌菌屬是unclassfiel_Chloroplast，在白茶、紅茶、生茶中占比分別為53%，36%和94%。真菌優勢菌屬各有不同，白茶中的優勢菌屬為枝孢屬菌（Cladosporium），相對豐度為4 3%，紅茶中優勢菌屬為籃狀菌屬（Talaromyces）、Gloeotinia屬，相對豐度為33%和31%，生茶優勢真菌菌屬是Gloeotinia屬，相對豐度為33%。通過主成分分析證明了加工工藝不同的三種茶葉微生物群落有較大差異。茶葉中的微生物主要是一些植物內生菌，此外還有一些腐生菌，腐生菌可能會對茶葉的儲藏和銷售時的品質安全性存在一定的影響，通過文章可對后續研究茶葉儲藏中品質與微生物的相關性研究提供參考，以保證茶葉儲藏中茶葉的品質及安全。