cGAS抑制劑對小鼠腦缺血再灌注損傷的干預作用及其機制

黃麗丹，李冰玉，李亞男，王蘇，龔平，2

1 武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060；2 武漢大學口腔醫院麻醉科 口腔基礎醫學省部共建國家重點實驗室培育基地和口腔生物醫學教育部重點實驗室

缺血性腦卒中是我國最常見的卒中類型，具有高發病率、高致殘率、高病死率的特點［1-3］。近年來我國缺血性腦卒中患者數量持續增加且呈現發病年輕化趨勢，給家庭和社會帶來了沉重的壓力［4-5］。尋求安全有效的治療方案是缺血性腦卒中相關研究的重點。早期靜脈溶栓或機械取栓、及時恢復腦血流是目前治療缺血性腦卒中的首選方案，但在腦組織恢復血供后常會出現損傷進一步加重的現象，即腦缺血再灌注損傷（CIRI）［6-7］。再灌注損傷是十分復雜的級聯反應，涉及多種因素與機制［8］。新近研究發現，環狀GMP-AMP 合酶（cGAS）天然免疫信號通路參與再灌注損傷的激活，同時有研究表明cGAS介導的天然免疫通路與細胞自噬密切相關［9-11］。對于cGAS 天然免疫信號通路是否能通過調控細胞自噬進而參與腦缺血再灌注損傷，以及抑制cGAS 激活對缺血再灌注損傷的干預作用，目前尚不明確。2021 年9 月—2022 年6 月，本研究觀察了cGAS 抑制劑RU. 521 對小鼠CIRI 的干預作用，并基于自噬相關蛋白表達調節探討相關機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 健康雄性C57BL/6 小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、實驗組，每組6 只。cGAS 抑制劑RU. 521 購自美國MedChemexpress 公司，HE 染色試劑和Nissl 染色試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司，cGAS抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，LC3B 購自美國CST 公司，Beclin-1 購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，TUNEL試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 模型制作及cGAS 抑制劑用法 模型組、實驗組采用線栓法制備大腦中動脈栓塞模型。參照課題組前期研究［12］中的方法，小鼠室溫下稱重麻醉后仰臥位固定，剪除術野毛發，碘伏消毒皮膚，頸部正中切口，顯微鏡下鈍性分離左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，避免損傷迷走神經，分別結扎頸總動脈近心端和頸外動脈起始處，在頸總動脈上系一活結，隨后在頸總動脈上剪一小缺口，將線栓沿頸總動脈插入頸內動脈，自頸總動脈分叉處進線9 ～ 10 mm。缺血1 h 后將線栓取出進行再灌注。假手術組分離大腦中動脈但不阻斷。實驗組于再灌注前10 min腹腔注射5 mg/kg的cGAS抑制劑RU.521。

1.3 腦組織損傷情況評估 于再灌注6 h后處死小鼠，分離顱骨取出腦組織，石蠟包埋后制備切片。部分切片依次使用二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，蘇木素染色并沖洗，1%鹽酸乙醇分色，0.6%氨水處理，HE染色觀察胞核和胞質染色情況；部分切片于載玻片上攤平，置于烤片機烤片，依次使用氯仿、梯度乙醇浸片。蒸餾水洗滌后室溫下焦油紫進行Nissl 染色觀察尼氏體。

1.4 腦組織細胞凋亡率檢測 取適量腦組織用多聚甲醛固定，制備石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，水浴鍋加熱0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液至95 ℃，放入切片加熱，待緩沖液冷卻后用PBS 清洗，滴加一抗黑暗處孵育過夜；次日37 ℃復溫，PBS 清洗，滴加二抗，室溫避光孵育后加入DAPI，黑暗中繼續孵育；采用抗熒光猝滅密封試劑進行密封；顯微鏡下拍照，觀察并計算凋亡細胞數，以凋亡細胞數除細胞總數計算凋亡率。

1.5 腦組織中cGAS、LC3B、Beclin-1 蛋白檢測 取適量組織加入RIPA后冰上裂解、離心、提取總蛋白，計算各樣品蛋白濃度。根據蛋白分子大小制備分離膠及濃縮膠，上樣后以90 V 電泳至Marker 分出條帶，轉至120 V 直至溴酚藍跑至分離膠底部終止電泳。將PVDF 膜置入轉移槽，加入預冷的電轉液，根據蛋白分子大小設定轉移時間進行電轉。加入cGAS（1∶500）、LC3B（1∶1 000）、Beclin-1（1∶500）一抗4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST 洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，ECL顯影，掃描后分析蛋白條帶灰度值。

1.6 統計學方法 采用Graph Pad Prism9.0 軟件。正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腦組織損傷情況比較 假手術組細胞未見病理改變；與假手術組相比，模型組病理學形態異常，主要表現為神經元形態不規則，固縮或消失，尼氏小體稀少或消失；與模型組相比，實驗組神經元形態相對規則，大部分細胞膜較完整，胞核較清晰，尼氏小體數量較多。見圖1。

圖1 各組小鼠腦組織病理變化

2.2 各組小鼠腦組織細胞凋亡率比較 模型組小鼠腦組織細胞凋亡率高于假手術組，實驗組細胞凋亡率低于模型組（P均＜0.05）。見表1。

2.3 各組小鼠腦組織中cGAS、LC3B、Beclin-1 蛋白表達比較 模型組小鼠腦組織中cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達高于假手術組，實驗組cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達低于模型組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腦組織細胞凋亡率及cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達比較（± s）

表1 各組小鼠腦組織細胞凋亡率及cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達比較（± s）

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術組模型組實驗組Beclin-1 1.000 ± 0.119 2.601 ± 0.170*1.615 ± 0.169#n 6 6 6凋亡率（%）5.1 ± 1.4 29.2 ± 1.6*14.1 ± 2.2#cGAS 1.000 ± 0.078 2.423 ± 0.259*1.827 ± 0.244#LC3B 1.000 ± 0.134 2.239 ± 0.148*1.472 ± 0.138#

3 討論

缺血性腦卒中是我國人口致死、致殘的主要因素，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔［13-14］。目前缺血性腦卒中的治療手段以溶栓或取栓為主，有助于恢復腦組織的有效灌注，但治療后常會出現更嚴重的并發癥即CIRI［15］。CIRI 是十分復雜的級聯反應，涉及氧化應激、炎癥反應、細胞自噬、興奮性毒性、鈣超載、線粒體功能受損等多種機制，而這些因素彼此關聯、相互作用，最終導致缺血區神經元的壞死和功能障礙［16-17］。因此，積極尋求減輕CIRI 的方案已成為臨床關注的熱點。

cGAS通路作為經典的天然免疫信號通路，可通過識別病原相關分子模式從而抵御病原體入侵，亦可利用損傷相關分子模式對機體進行監控，是機體抵御病原體入侵的關鍵性自我監控防御系統［18-19］。近期cGAS 通路在非免疫生理過程中的作用亦受到重視。研究發現，cGAS 通路可參與DNA 損傷修復過程，并通過介導核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶等內源性通路激活參與機體穩態的調控［20-21］。新近研究發現，激活cGAS 通路不僅能產生強大的天然免疫反應，還可調控多種形式的細胞死亡和應激反應［22］。有學者發現，cGAS通路在再灌注初期功能顯著上調［23］。因此，若能在再灌注早期進行及時干預則有望減輕腦損傷，對臨床防治CIRI 產生重要價值。

研究表明，cGAS通路激活與自噬依賴的細胞死亡有關［24］。端粒損傷可促進DNA 片段釋放進入細胞質，進而導致過度自噬的發生，表現為自噬相關蛋白LC3 表達上調和p62 表達下調，抑制自噬或cGAS通路則可明顯改善細胞的狀態［25-26］。進一步研究發現，cGAS 共有5 個LC3 相互作用區域［27］，同時cGAS還可與自噬相關蛋白Beclin-1 相互作用，釋放自噬負調控因子，負反饋調節自噬過程［28］。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組腦組織中cGAS 表達升高，同時伴隨著神經元形態不規則、細胞固縮、尼氏小體溶解或消失等現象，細胞凋亡率亦呈升高趨勢，提示CIRI 過程中cGAS 升高可導致神經元的損傷。

自噬可通過自我消化和循環利用細胞內受損的細胞器及錯誤折疊或聚集的蛋白質等，維持細胞內穩態和正常功能［29-30］。自噬通常被認為是一種促生存的機制，但亦有研究認為自噬是一種Ⅱ型程序性細胞死亡方式［31］。研究表明，適度自噬可發揮保護性作用，而過度自噬則可能成為細胞死亡的驅動因素。如在機體處于氧化應激、再灌注損傷等病理狀態下，自噬激活可通過加速受損細胞器的更新和動員細胞內能量儲存從而維持代謝平衡，但再灌注后過度激活的自噬又會導致正常細胞結構受損進而引起程序性細胞死亡［32-33］。自噬相關蛋白LC3B、Beclin-1 對自噬的進展具有決定性作用，二者表達升高可能導致細胞死亡。本研究結果顯示，模型組腦組織中LC3B、Beclin-1表達高于假手術組，細胞凋亡率高于假手術組，與相關研究結果一致［34-35］。

本研究模型組和假手術組的實驗結果表明，激活cGAS 通路可通過增強自噬導致腦損傷。已有研究表明，cGAS 抑制劑RU.521 可透過血腦屏障發揮抑制cGAS 的作用。用5 mg/kg 的RU.521 對小鼠進行腹腔注射可獲得穩定的抑制效果［36-38］。本研究采用cGAS 選擇性抑制劑RU.521 對小鼠腹腔注射，發現病灶腦組織中自噬相關蛋白LC3B、Beclin-1 表達降低，細胞凋亡率下降，同時神經元形態相對規則，大部分包膜較完整，胞核較清晰，尼氏小體數量較多，表明抑制cGAS 通路后自噬下調，進而細胞凋亡減少。

綜上所述，小鼠CIRI 狀態下cGAS 天然免疫通路功能上調，可促進細胞自噬激活，增加細胞凋亡進而加重腦損傷；cGAS抑制劑預處理可減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與調節自噬有關。