腺苷預處理的腦缺血再灌注大鼠腦損傷程度及IL-1β、IL-6、COX-2表達觀察

姚靜靜，譚軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三臨床學院，河南新鄉(xiāng) 453003

缺血性腦卒中病情重、預后差，嚴重影響患者生活質量［1］。早期開展靜脈溶栓或血管內介入治療、恢復腦缺血部位血供是缺血性腦卒中首選的治療方法［2］。然而缺血再灌注可能引起腦損傷，導致更廣泛的神經功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應是引發(fā)腦缺血再灌注損傷的關鍵因素［3-4］。腦缺血時，缺血核心區(qū)腦細胞急性死亡觸發(fā)炎癥因子過度表達和炎癥介質釋放，大量炎癥細胞聚集在腦缺血半暗帶產生細胞毒性，導致血腦屏障功能破環(huán)，出現(xiàn)腦水腫，此時即便大血管恢復血供，缺血半暗帶區(qū)的微循環(huán)依然“無復流”，繼發(fā)性神經元損傷不斷擴大［4］。炎癥因子白細胞介素（IL）1β、IL-6及炎癥介質環(huán)氧化酶2（COX-2）在炎癥反應中發(fā)揮重要作用［5-6］。腺苷是天然存在的內源性嘌呤核苷，有助于維持細胞和組織穩(wěn)態(tài)。通常情況下，腺苷在細胞外濃度極低，但在病理狀態(tài)（如癲癇、缺血、疼痛、炎癥和惡性腫瘤等）、代謝需求增加或缺氧的情況下，腺苷水平會顯著升高［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血前進行腺苷預處理能夠通過抑制炎癥因子TNF-α、NF-κB 的表達［8］，減輕腦缺血再灌注損傷。2021 年10 月—2022年10月，本研究構建大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，通過觀察腺苷預處理的腦缺血再灌注大鼠腦損傷程度及IL-1β、IL-6、COX-2 表達變化，探討腺苷對腦組織的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 雄性SPF級SD大鼠85只，體質量250 ～ 300 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于SPF 級環(huán)境中，自由飲食，室內溫度控制在（23 ± 2）℃。腺苷購自北京索萊寶科技有限公司，TUNEL 染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，即用型免疫組化試劑盒購自福州市邁新生物技術開發(fā)公司，ELISA 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。線栓的制備：將長約5 cm、直徑0.26 mm 的尼龍線頂端燒燙為光滑圓球，用硅膠潤滑脂包被頭端5 ～ 6 mm，距膨大端20 mm處用防水筆做記號，75%乙醇浸泡消毒后，置于肝素生理鹽水中備用。

1.2 模型制作與分組處理 將85 只大鼠隨機分為空白組10 只及假手術組、模型組、腺苷組各25 只。模型組、腺苷組采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，參考KOIZUMI 等［9］的方法加以改良：用10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，將麻醉成功的大鼠消毒備皮后，頸正中切口切開，分離大鼠右頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）；結扎CCA 近心端及ECA，在ICA 近分叉處使用微動脈血管夾將血管夾閉，在CCA 近分叉處留置一打好單結但不收緊的絲線；在CCA 的兩線間用眼科剪作“V”形微切口，插入膨大的線栓頭端，線栓沿CCA 經ICA送入顱內，當頭端插入18 ～ 20 mm 遇到輕微阻力感時，停止進線；收緊CCA 遠心端的線結，消毒縫合切口，2 h 后，在大鼠麻醉狀態(tài)下將線栓輕輕向外拔出1.0 cm 左右。術中、術后注意維持大鼠體溫。腺苷組造模前連續(xù)3 d 腹腔注射1.5 mg/kg 的腺苷溶液2 mL，假手術組和模型組造模前連續(xù)3 d 腹腔注射生理鹽水2 mL。假手術組術中不插入線栓。空白組不予任何處理。將缺血性腦損傷癥狀典型（神經功能缺損評分1 ～ 3 分）的大鼠納入后續(xù)實驗，將無腦損傷癥狀和神經功能嚴重受損（評分為0、4分）的大鼠排除實驗。因剔除大鼠致樣本量減少時，隨機選擇同一批次、同等條件下飼養(yǎng)的SD大鼠重新進行模型制備，補足樣本量。假手術組、模型組及腺苷組分別于再灌注后6、12、24、48 h 各取5 只大鼠脫臼取腦；空白組不分時間點，隨機取5 只大鼠脫臼取腦。將大鼠腦組織沿冠狀面切開，將靠近額極的一半缺血半暗帶腦皮質層（空白組、假手術組取同部位腦組織）用于ELISA 檢測；另一半腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定后，脫水，透明，石蠟包埋，從頂葉端沿冠狀面切成厚4 μm的組織切片，用于免疫組化檢測。各組剩余5只大鼠進行腦組織TTC染色，計算腦梗死體積。

1.3 神經功能缺損評價 于再灌注后24 h 進行神經功能缺損評分。神經功能正常計0 分，提尾時大鼠左前肢屈曲計1 分，大鼠于光滑平面上行走時左側轉圈計2 分，大鼠靜止狀態(tài)下向左側傾斜計3 分，大鼠意識減退、肢體無自發(fā)活動計4分。

1.4 腦梗死體積測算 各組于再灌注后24 h 各取5 只大鼠取腦，在全腦視交叉及其前后各2 mm 處作冠狀切4 刀，將腦標本切成5 片，置于5 mL 含有2% TTC 的磷酸緩沖溶液中，37 ℃避光溫孵20 min。用數碼相機拍照，之后用眼科鑷分離缺血區(qū)（蒼白色）和非缺血區(qū)（紅色），采用Image pro plus6.0 軟件分析并計算腦梗死面積占比。腦梗死體積占比=缺血區(qū)體積/（缺血區(qū)體積+非缺血區(qū)體積）×100%。

1.5 腦細胞凋亡率測算 制備好的腦石蠟切片脫蠟水化后，滴加100 μL 的Proteinase K 工作液，37 ℃反應30 min，浸入3% H2O2封閉液中室溫封閉10 min，每個樣本上滴加50 μL 的TdT 酶反應液，37 ℃避光反應60 min，DAPI 復染細胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察，隨機選取3 個腦皮質區(qū)缺血半暗帶在高倍鏡（400×）視野下拍照，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/視野內總細胞數×100%。

1.6 病灶腦組織IL-1β、IL-6 檢測 將腦組織剪碎，按照1∶9 體質量體積比加入PBS，冰上勻漿，4 ℃ 3 500 r/min 離心10 min，取上清進行檢測。在酶標板上每孔加入100 μL 的標準品或待測樣品，之后依次加入生物素化抗體工作液、洗滌液、酶結合物工作液、底物溶液、終止液，酶標儀檢測450 nm 波長處的光密度值，計算樣本濃度。

1.7 病灶腦組織COX-2 檢測 將制好的石蠟切片脫蠟，水化，采用HE 染色，按照試劑盒說明書操作。使用相差顯微鏡在高倍鏡（400×）視野下隨機選取3個腦皮質區(qū)缺血半暗帶視野拍照，計算COX-2 表達指數。COX-2 表達指數=COX-2 染色平均陽性細胞數/視野內總細胞數×100%

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布、方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD 檢驗，重復測量資料采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布的計量資料以M（IQR）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺陷評分比較 空白組、假手術組、模型組、腺苷組神經功能缺損評分分別為0.0（0.0，0.0）、0.0（0.0，0.0）、3.0（2.0，3.0）、1.0（1.0，2.0）分，模型組、腺苷組神經功能缺損評分高于空白組和假手術組，腺苷組神經功能缺損評分低于模型組（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦梗死體積占比及腦細胞凋亡率比較 空白組及假手術組大鼠未出現(xiàn)神經功能障礙，腦TTC 染色未見梗死灶。空白組、假手術組、模型組、腺苷組腦梗死體積占比分別為0、0、44.68% ± 2.80%、29.71 ± 2.39%，腦細胞凋亡率分別為4.84% ± 1.87%、6.30% ± 1.48%、51.00% ± 4.70%、32.51% ± 4.86%。模型組、腺苷組大鼠腦梗死體積占比及腦細胞凋亡率高于空白組和假手術組，腺苷組腦梗死體積占比及腦細胞凋亡率低于模型組（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織IL-1β、IL-6 表達比較 模型組、腺苷組腦組織中IL-1β、IL-6 表達在再灌注6、12 h逐漸上升，于再灌注24 h時最高，48 h后開始下降。再灌注后12、24 h，假手術組大鼠腦組織IL-1β表達高于空白組（P均＜0.05）；模型組、腺苷組再灌注6、12、24、48 h腦組織中IL-1β、IL-6表達高于空白組和假手術組，腺苷組IL-1β、IL-6 表達低于模型組（P均＜0.05）。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠再灌注后不同時點腦組織IL-1β表達比較（pg/mg，± s）

表1 各組大鼠再灌注后不同時點腦組織IL-1β表達比較（pg/mg，± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與假手術組相比，bP＜0.01；與模型組相比，cP＜0.01。

組別腺苷組模型組假手術組空白組n 5 5 5 5 IL-1β 48 h 95.26 ± 3.49abc 123.46 ± 6.87ab 49.32 ± 4.71 44.94 ± 1.63 6 h 73.32 ± 2.69abc 87.44 ± 5.15ab 47.46 ± 3.26 44.94 ± 1.63 12 h 92.86 ± 4.50abc 108.34 ± 6.67ab 51.42 ± 4.23a 44.94 ± 1.63 24 h 103.54 ± 5.87abc 134.26 ± 6.48ab 51.52 ± 2.55a 44.94 ± 1.63

表2 各組大鼠再灌注后不同時點腦組織IL-6表達比較（pg/mg，± s）

表2 各組大鼠再灌注后不同時點腦組織IL-6表達比較（pg/mg，± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與假手術組相比，bP＜0.01；與模型組相比，cP＜0.01。

組別腺苷組模型組假手術組空白組n 5 5 5 5 IL-6 48 h 85.15 ± 7.82abc 105.05 ± 5.21ab 30.03 ± 2.68 29.31 ± 2.62 6 h 37.76 ± 2.34abc 52.30 ± 4.16ab 31.06 ± 2.46 29.31 ± 2.62 12 h 64.03 ± 3.13abc 77.50 ± 3.01ab 30.12 ± 2.72 29.31 ± 2.62 24 h 102.51 ± 4.40abc 150.79 ± 7.26ab 32.52 ± 2.09 29.31 ± 2.62

2.4 各組大鼠腦組織中COX-2 表達比較 模型組、腺苷組腦組織中COX-2 表達在再灌注6、12 h 逐漸上升，于再灌注24 h 時最高。再灌注后24 h，假手術組腦組織COX-2 表達高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組、腺苷組再灌注后6、12、24、48 h 腦組織COX-2 表達均高于空白組和假手術組，腺苷組COX-2 表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學 意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠再灌注后不同時點腦組織COX-2表達比較（± s）

表3 各組大鼠再灌注后不同時點腦組織COX-2表達比較（± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與假手術組相比，bP＜0.01；與模型組相比，cP＜0.01。

組別腺苷組模型組假手術組空白組n 5 5 5 5 COX-2 48 h 22.59 ± 2.40abc 37.55 ± 3.97ab 11.07 ± 1.45 7.76 ± 0.99 6 h 18.33 ± 2.09abc 29.56 ± 3.74ab 8.82 ± 1.36 7.76 ± 0.99 12 h 19.18 ± 2.75abc 32.90 ± 2.69ab 10.31 ± 1.79 7.76 ± 0.99 24 h 27.00 ± 1.44abc 37.60 ± 3.02ab 11.40 ± 2.11a 7.76 ± 0.99

3 討論

建立腦缺血再灌注動物模型是研究腦缺血再灌注損傷病理生理機制和治療方案的重要方法。本研究中，模型組和腺苷組大鼠造模后出現(xiàn)明顯的神經功能障礙，癥狀特點與臨床上觀察到的大腦中動脈梗死患者相似。腦TTC 染色結果顯示，模型組及腺苷組大鼠右側大腦出現(xiàn)典型的染色缺失區(qū)，染色缺失區(qū)主要為大腦皮層及紋狀體區(qū)域，與大腦中動脈支配區(qū)域相符。于大鼠腦缺血再灌注24 h 時進行TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)，模型組和腺苷組缺血半暗帶腦細胞凋亡率較假手術組增多，表明在缺血腦組織中，即便在短時間內進行再灌注，缺血半暗帶腦細胞仍然發(fā)生了不可逆轉的損害，腦細胞出現(xiàn)進行性凋亡。

大腦預處理是指預先將大腦暴露于某些亞致死性刺激，誘發(fā)較短暫的內源性保護機制，以此來提高大腦對該因素的耐受性或適應性［10］。在大腦預處理中，腺苷是內源性神經保護作用的重要介質。GENG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，電針預處理可通過激活腺苷A1受體，保護缺血再灌注損傷的神經元。唐偉等［12］研究認為，針刺預處理的腦保護作用機制與增強內源性腺苷含量密切相關。本研究中，經過腺苷預處理的大鼠在腦缺血再灌注24 h后精神狀態(tài)明顯好于模型組，腦梗死體積縮小，神經細胞凋亡減少，神經功能缺損評分降低，再次驗證了腺苷預處理能減輕腦缺血再灌注損傷。

在缺血腦組織重建血流可能會觸發(fā)一系列直接或間接的神經元凋亡、血腦屏障破壞、腦水腫和出血性轉化等繼發(fā)性損傷，這與缺血腦組織內大量促炎細胞因子釋放觸發(fā)的神經炎癥級聯(lián)反應密切相關［13］。IL-1β和IL-6是最常見的促炎細胞因子，腦缺血時IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子過度釋放在可加劇腦水腫，促進神經細胞死亡，引發(fā)炎癥反應［14］。在腦缺血損傷中，活化的神經膠質細胞、白細胞、血管內皮細胞大量表達IL-1β和IL-6，進一步促使趨化因子和黏附分子表達增強，這使得更多炎癥細胞在缺血區(qū)毛細血管末端發(fā)生聚集、黏附，腦血流速度進一步降低，加重腦水腫；募集的炎癥細胞還能合成繼發(fā)性損傷相關的細胞因子如白三烯、前列腺素等，導致毛細血管內皮細胞結構和功能損傷，血腦屏障破壞［15-16］。本研究結果顯示，再灌注后12、24 h，假手術組大鼠腦組織IL-1β 表達高于空白組，而在術后48 h，假手術組IL-1β表達接近空白組，表明IL-1β為較為敏感的炎癥因子，暴露血管的手術操作引起大鼠體內IL-1β 水平發(fā)生一定程度的變化，但在術后48 h 能基本恢復至正常水平。模型組、腺苷組再灌注6、12、24、48 h后腦組織中IL-1β、IL-6表達高于空白組和假手術組，腺苷組IL-1β、IL-6 表達低于模型組，進一步表明IL-1β 與IL-6 參與了腦缺血再灌注損傷，腺苷預處理能在腦缺血再灌注損傷急性期發(fā)揮抗炎作用。我們還發(fā)現(xiàn)，模型組、腺苷組腦組織中IL-1β、IL-6 表達于再灌注6、12 h 逐漸上升，于再灌注24 h時最高，48 h后開始下降，這為進一步研究抗炎治療時間窗提供了依據。

COX-2 在腦缺血時被大量誘導表達，是炎癥反應的標志，與神經元凋亡及壞死密切相關［17］。在腦缺血缺氧時，神經細胞膜電位失衡，大量Ca2+內流，激活降解神經細胞膜磷脂的磷脂酶A2，大量的花生四烯酸（AA）由神經細胞膜降解而來［18］。COX-2 是AA 經酶促代謝中的關鍵酶，AA 在COX-2 的催化下分解出大量氧自由基、前列腺素和血栓素等［19］，導致血管內皮細胞損傷，血管收縮，血小板活化，炎癥反應進展。方曉艷等［20］使用免疫組化染色法觀察大鼠腦組織中COX-2 陽性表達情況，發(fā)現(xiàn)COX-2 存在于大鼠缺血側腦額頂葉神經元的胞質中。本實驗中，四組大鼠腦皮質層中均出現(xiàn)COX-2 陽性細胞，COX-2 定位于細胞質，與之前報道一致。假手術組再灌注后24 h 腦組織中COX-2 表達高于空白組，提示手術操作可能引起了一定程度的COX-2 表達增強，但在可控范圍內。模型組COX-2 表達在缺血半暗帶腦皮質區(qū)顯著增多，于再灌注24 h達到高峰，這與IL-1β、IL-6 表達升高時間相似，推測IL-1β、IL-6表達升高與COX-2 表達上調具有相互促進作用，共同促進炎癥反應進展。腺苷預處理后各時間點，大鼠腦組織COX-2 表達均低于模型組，提示腺苷預處理的腦保護作用也與降低腦內COX-2表達有關。

綜上所述，腺苷預處理能夠減輕腦缺血再灌注后大鼠腦損傷，腺苷可能通過調節(jié)IL-1β、IL-6、COX-2表達從而發(fā)揮神經保護作用。以上實驗結果為臨床應用腺苷預處理防治腦缺血再灌注損傷提供了參考。