抑制lncR-HOXA-AS3表達的人前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及EMT相關蛋白表達變化

朱研峰，劉志飛，邢力永，孟建利，謝華，鄧剛，雷竹卿

唐山市人民醫院泌尿外科，河北唐山 063000

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著我國老齡化趨勢的增加，PCa的發病率呈現上升趨勢［1］。PCa發病隱匿，多數患者確診時已是晚期，手術治療、放化療及內分泌治療等傳統治療方法對于早期PCa患者治療效果尚可，但這些方法對于晚期轉移性PCa患者治療效果較差，患者預后較差［2-3］。PCa發生及轉移的分子機制尚未闡明，因此探索其發生發展機制對改善晚期PCa患者的預后意義重大。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 nt的非編碼單鏈RNA，可通過多種不同的分子路徑參與機體基因表達的調控，并且與惡性腫瘤的發生發展有關［4］。lncR-HOXA-AS3是近年來發現不久的lncRNA家族成員，在多種惡性腫瘤細胞中表達異常，參與調控腫瘤細胞的惡性表型［5-6］。目前lncR-HOXA-AS3在PCa發生發展中的作用機制尚不清楚。因此，我們觀察了抑制lncRHOXA-AS3表達對PCa細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并探討其可能作用機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系及試劑 人正常前列腺細胞系RWPE-1及人PCa細胞系DU-145、LNCaP、C4-2B均購自中國典型培養物保藏中心。TRIzol試劑購自北京天根生化公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）試劑盒均購自日本TaKaRa公司；PCR引物、lncR-HOXA-AS3沉默質粒si-HOXA-AS3和陰性對照質粒si-NC均購自上海吉瑪制藥技術公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖維連接蛋白（Fibronectin）及GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 受試細胞篩選 采用qRT-PCR法檢測DU-145、LNCaP、C4-2B 及 RWPE-1細胞 lncR-HOXAAS3，篩選受試細胞。取DU-145、LNCaP、C4-2B細胞接種至RPMI 1460培養基（含10% 胎牛血清），RWPE-1細胞接種至D-KSFM培養基（含10%胎牛血清）中培養。采用qRT-PCR法檢測lncR-HOXAAS3。應用TRIzol法提取DU-145、LNCaP、C4-2B和RWPE-1細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA，應用qRT-PCR試劑盒按照說明書加入PCR引物，進行PCR反應進行擴增反應。PCR反應條件如下：94 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共40個循環。lncR-HOXA-AS3引物序列：上游序列：5'- AGGAAACATCAGGGCGTACA -3'，下游序列：5'-ATCCTAAGTGCTTGCACCCT -3'；內參U6引物序列：上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游 ：5'- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。 以 2-△△Ct代表lncR-HOXA-AS3的相對表達量，重復檢測3次，取平均值。RWPE-1、DU-145、LNCaP及C4-2B細胞lncR-HOXA-AS3相對表達量分別為0.99 ± 0.03、1.69 ± 0.08、1.98 ± 0.14、1.73 ± 0.15。與RWPE-1相比，DU-145、LNCaP、C4-2B 細胞中 lncR-HOXAAS3相對表達量表達均升高（P均＜0.05）。因為LNCaP 細胞lncR-HOXA-AS3的相對表達量最高，因此選擇LNCaP細胞系作為本研究的實驗細胞。

1.3 LNCaP 細胞分組及si-HOXA-AS3轉染方法 取對數生長期LNCaP細胞接種于6孔細胞板內，分為觀察組、對照組，每組6個復孔，分別轉染lncRHOXA-AS3（抑制si-HOXA-AS3表達）和si-NC（陰性對照），應用LipofectamineTM3000按照說明書操作，轉染12 h后，將培養基更換為含10% 胎牛血清的RPMI 1460培養基，繼續放置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中培養中繼續培養48 h。

1.4 兩組細胞lncR-HOXA-AS3檢測 培養48 h時取兩組細胞，用qRT-PCR法檢測lncR-HOXA-AS3，所有操作均同“1.2”。重復檢測3次，取平均值。

1.5 兩組細胞增殖活性檢測 分別于轉染24、48、72 h時采用CCK8實驗檢測兩組細胞增殖活性。將各組LNCaP細胞接種于96孔板，細胞密度為1×105/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，繼續培養72 h后給予每孔滴加10 μL的CCK8 試劑，繼續孵育2 h，全自動酶標儀檢測各孔的光密度（OD450nm）值。以OD值代表細胞的增殖活性。重復檢測3次，取平均值。

1.6 兩組細胞遷移能力觀察 轉染48 h時采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。收集兩組細胞按照細胞密度5×105/孔接種至6孔細胞板，在恒溫細胞箱中培養至細胞匯合度達90%左右時，應用10 μL移液器吸頭垂直于細胞板劃“一”字劃痕，PBS 沖洗細胞板后，細胞繼續培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察并計算劃痕愈合率。重復測算3次，取平均值。

1.7 兩組細胞侵襲能力觀察 轉染48 h時采用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。首先應用Mgtrigel膠包被Transwell小室底膜上室面。首先無血清細胞培養基重懸細胞，制作1×105/mL的各組LNCaP細胞懸液，將100 μL細胞懸液加入到Transwell小室上室，下室加完全細胞培養基500 μL， 繼續培養48 h后取出小室，拭去未穿膜細胞，多聚甲醛固定，結晶紫溶液染色，倒置顯微鏡進行穿膜細胞計數。重復測算3次，取平均值。

1.8 兩組上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）相關蛋白Vimentin、Fibronectin、 E-cadherin檢測 轉染48 h時采用WESTERN Blotting法檢測兩組Vimentin、Fibronectin、 E-cadherin。取兩組細胞，裂解細胞提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取50 μg總蛋白樣品進行上樣，采用10% SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，將膜用含5 %脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉2 h，分別加入一抗（Vimentin、E-cadherin、Fibronectin、GAPDH）后，4 ℃次日孵育過夜，洗膜結束后加入二抗，室溫孵育2 h，應用ECL顯影液顯影，Gene Tools軟件分析蛋白的相對表達量。重復測算3次，取平均值。

1.9 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理。采用P-P圖檢驗數據的正態性，符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較應用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組LNCaP細胞lncR-HOXA-AS3相對表達量比較 觀察組、對照組細胞lncR-HOXA-AS3相對表達量分別為0.39 ± 0.11、1.01 ± 0.05，二者比較，t=12.57，P＜0.05）。

2.2 轉染24、48、72 h時兩組LNCaP細胞OD值比較 轉染24、48、72 h時兩組LNCaP細胞OD值見表1。與對照組比較，觀察組轉染24、48、72 h時LNCaP細胞OD值均下降，二者比較，t=8.33，6.12，8.44；P均＜0.05。

表1 轉染24、48、72 h時兩組LNCaP細胞OD值（）

表1 轉染24、48、72 h時兩組LNCaP細胞OD值（）

組別觀察組對照組OD值24 h 0.45 ± 0.12 1.13 ± 0.16 48 h 0.69 ± 0.17 1.53 ± 0.29 72 h 1.15 ± 0.22 2.46 ± 0.31

2.3 轉染48 h時兩組劃痕愈合率比較 轉染48 h時觀察組、對照組劃痕愈合率分別為20.1% ±3.8%、65.3% ± 4.3%，二者比較，t=19.29，P＜0.05。2.4 轉染48 h時兩組侵襲穿膜細胞數比較 轉染48 h時觀察組、對照組侵襲穿膜細胞數分別為（223 ± 40）、（96 ± 24）個，二者比較，t=6.67，P＜0.05。2.5 轉染48 h時兩組細胞Vimentin、Fibronectin、E-cadherin相對表達量比較 轉染48 h時兩組細胞Vimentin、Fibronectin、 E-cadherin相對表達量見表2。與對照組比較，觀察組細胞E-cadherin蛋白相對表達量高，Fibronectin、Vimentin蛋白相對表達量低（t=6.74，5.46，7.33；P均＜0.05）。

表2 轉染48 h時兩組細胞E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白相對表達量（）

表2 轉染48 h時兩組細胞E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白相對表達量（）

組別觀察組對照組E-cadherin 1.33 ± 0.16 0.78 ± 0.12 Fibronectin 0.21 ± 0.09 0.60 ± 0.15 Vimentin 0.32 ± 0.10 0.91 ± 0.17

3 討論

PCa是全世界男性最常見的惡性腫瘤之一。根據美國2022年統計，PCa是男性新發病例最多的疾病，也是男性癌癥相關死亡的第二大原因［7］。近年來，隨著我國國內老齡化趨勢的到來，PCa的發病率亦呈現明顯上升的趨勢，成為我國男性第五大惡性腫瘤，嚴重威脅著老年男性的生命健康。盡管過去幾十年PCa在診斷、手術技術和輔助治療方面取得了重大進展，但PCa發病率和死亡率仍在快速上升，對于復發性及轉移性PCa患者目前仍缺乏有效的治療方法［8］。近年來，隨著表觀遺傳學和人類基因組研究的不斷發展和進步，分子靶向治療在許多惡性腫瘤的治療中重要作用逐漸顯現，對于提高惡性腫瘤的治療療效起到很大的幫助，成為將來腫瘤治療的研究熱點問題。目前PCa的分子靶向治療尚缺乏有效的基因靶點，因此，探索PCa發生進展的分子機制是尋找有效治療PCa的必要條件。

lncRNA是一種內源性轉錄RNA分子，位于細胞核或細胞質，缺乏開放閱讀框，LncRNA沒有蛋白質編碼功能，但可以RNA的形式通過調節表觀遺傳學、轉錄和后轉錄的形式調節基因的表達，從而導致疾病和腫瘤的發生發展［9］。在腫瘤發生發展的基因調控網絡中，lncRNA的異常調控已經是不可或缺的組成部分。研究［10］發現，lncRNA的異常表達與PCa的發生發展、轉移和預后密切相關。lncR-HOXA-AS3是新近發現的HOX基金家族簇成員，lncRHOXA-AS3與多種惡性腫瘤的發病機制有關，并且可能通過影響腫瘤細胞惡性參與腫瘤的進展。ZHANG等［11］學者發現lncR-HOXA-AS3肺腺癌組織和細胞中均顯著上調，敲除lncR-HOXA-AS3，癌細胞增殖、遷移和侵襲受到抑制，并且異種移植物的腫瘤重量和體積均顯著減小。JIANG等［12］報道特異性siRNA敲低lncR-HOXA-AS3顯著抑制結腸癌細胞的增殖、誘導細胞周期停滯并促進細胞的凋亡。近期研究發現在胃癌［13］、胰腺癌［14］、肝癌［15］等多種惡性腫瘤組織和細胞中lncR-HOXA-AS3表達異常，與腫瘤細胞的過渡增殖、侵襲、遷移等惡性表型有關。lncR-HOXA-AS3與膀胱癌和小細胞肺癌細胞對化療藥物的耐藥性有關。CHEN等［16］研究發現，缺氧促進了膀胱癌細胞對順鉑的耐藥性，并上調膀胱癌細胞中lncR-HOXA-AS3相對表達量，抑制lncRHOXA-AS3通過調節膀胱癌細胞中Notch1表達來增強缺氧誘導的順鉑敏感性。張昆等［17］發現，敲低lncR-HOXA-AS3表達可抑制小細胞肺癌細胞增殖、促進其凋亡，進而增強DMS114/DDP細胞的順鉑敏感性。但lncR-HOXA-AS3是否能夠前列腺癌細胞增殖、侵襲及遷移等腫瘤細胞惡性表型及作用機制尚不清楚。本研究通過qRT-PCR法檢測多個PCa細胞系中lncR-HOXA-AS3的相對表達量，結果顯示DU-145、LNCaP、C4-2B等多個 PCa細胞系中 lncRHOXA-AS3的表達均較正常前列腺細胞系RWPE-1明顯升高，說明PCa細胞系中lncR-HOXA-AS3異常高表達，提示lncR-HOXA-AS3的異常升高可能與PCa的發生發展有關，可能在PCa的發生發展中起著癌基因的作用。

為了進一步探討lncR-HOXA-AS3在PCa發生發展中的具體機制，觀察lncR-HOXA-AS3對PCa細胞腫瘤細胞惡性表型的影響，我們通過選擇lncRHOXA-AS3表達最多的細胞系為LNCaP作為后續的研究對象，通過轉染沉默質粒si-HOXA-AS3至LNCaP細胞，成功抑制LNCaP細胞中lncR-HOXAAS3表達，應用CCK-8實驗觀察細胞活性變化，結果發現LNCaP細胞24、48、72 h時細胞OD值均明顯下降，提示抑制LNCaP細胞lncR-HOXA-AS3表達后，細胞增殖活性受到明顯的抑制。本研究通過細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗發現，抑制LNCaP細胞lncR-HOXA-AS3表達后，細胞劃痕愈合率和侵襲穿膜細胞數目亦明顯下降，提示抑制Pca細胞中lncRHOXA-AS3表達能夠抑制癌細胞的侵襲及遷移能力。

EMT是以上皮細胞極性的喪失及間質特性的獲得為主要特征，EMT發生過程中，上皮細胞源性標志物E-cadherin的表達降低，間質細胞源性標志物Fibronectin、Vimentin等表達升高，并且細胞外基質成分顯著增加。EMT最早發現于發育生態學，近年來研究發現EMT在癌細胞原位侵襲和遠處轉移的過程中起著關鍵性作用。EMT可以使得同種細胞間黏附能力顯著下降，降低了細胞極性，細胞間連接松散，細胞失去極性排列，利于癌細胞的侵襲和轉移［18］。抑制PCa細胞的EMT過程能夠有效的抑制癌細胞的侵襲及轉移［19］。近期在對膀胱癌［16］和肝癌［20］的研究中發現lncR-HOXA-AS3與癌細胞的EMT過程相關，抑制癌細胞中lncR-HOXA-AS3表達能夠升高癌細胞上皮細胞源性標志物E-cadherin蛋白水平，降低間質細胞源性標志物Fibronectin、Vimentin等蛋白表達水平，抑制EMT的發生，從而抑制癌細胞的侵襲轉移過程。然而，lncR-HOXA-AS3對PCa細胞侵襲、遷移的影響是否與其對EMT的影響有關尚不清楚。本研究中我們發現，轉染沉默質粒si-HOXA-AS3的LNCaP細胞E-cadherin蛋白相對表達量升高，而Fibronectin、Vimentin等蛋白相對表達量明顯降低。以上提示抑制lncR-HOXA-AS3表達能夠抑制PCa細胞的EMT過程。

綜上所述， Pca細胞中lncR-HOXA-AS3高表達。抑制lncR-HOXA-AS3表達能抑制PCa細胞的增殖、遷移、侵襲，可能與lncR-HOXA-AS3促進E-cadherin蛋白表達抑制Vimentin、Fibronectin蛋白表達有關。本研究尚存在一定局限性，未進一步分析lncR-HOXA-AS3調控PCa細胞惡性腫瘤學表型的下游分子機制，將會在后續研究中進一步探討展開。