泛耐藥銅綠假單胞菌菌株廣譜噬菌體裂解酶的獲取及抗菌活性觀察

王猛，蔡大敏 ，王景雨，王策，邵煜涵，穆紅

1 南開大學附屬天津市第一中心醫院檢驗科，天津 300192；2 杭州醫學院檢驗學院；3 天津醫科大學檢驗學院

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一種非發酵的革蘭氏陰性桿菌。PA是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界和人體皮膚、黏膜、呼吸道、胃腸道等部位中［1］。免疫力低下或不當介入性操作后PA可引起皮膚、呼吸道、泌尿道等系統感染，嚴重時可導致菌血癥、心內膜炎等［2］，是院內感染的主要病原菌之一［3］。抗生素的廣泛使用導致PA耐藥株的出現，目前PA耐藥率位居革蘭氏陰性桿菌首位。PA已成為醫院內獲得性感染中最常見的多重耐藥條件致病菌［4］。因此，要研究新抗菌方法來預防和治療泛耐藥PA導致的感染，是目前的研究熱點。噬菌體（Bacteriophage）又被稱為細菌病毒，是一類以微生物（包括細菌、螺旋菌、放線菌或真菌等）為宿主的病毒，通過特異性的侵入細菌，利用菌體內部的功能結構，合成自身成份，完成復制繁殖［5］。噬菌體可分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體［6］。其中裂解性噬菌體在感染宿主菌后可立即啟動自身基因表達，通過基因表達產物降解宿主DNA，終止宿主基因表達，奪取宿主DNA復制亞細胞功能結構，大量合成噬菌體核酸并表達噬菌體結構蛋白，在宿主菌菌體內組裝產生下一代噬菌體，當宿主菌內噬菌體積累到一定水平，可促進噬菌體穿孔素表達，穿孔素導致宿主菌內膜形成孔洞，同時噬菌體釋放的裂解酶（endolysin）可分解細菌細胞壁，最終導致細菌裂解死亡［7］。裂解性噬菌體能夠特異性地裂解細菌，對正常菌群和人體細胞不構成影響，且作用機制抗生素不同［8］。但使用噬菌體治療細菌感染可能存在一些不足，如噬菌體裂解細菌導致機體免疫反應、某些噬菌體攜帶的毒素基因引起機體毒素反應、噬菌體自由增殖及噬菌體應用劑量的把握等問題［9］。噬菌體還存在抗菌譜，對同種細菌不同菌株的抗菌效果也存在一定不同［10］。對噬菌體裂解酶進行修飾，可能解決噬菌體毒素反應、劑量控制、抗原性等不足，為細菌感染的治療提供了新思路，可能成為治療細菌感染的新方法。目前國內外關于噬菌體裂解酶用于拮抗細菌的研究報道并不多見，有關泛耐藥PA菌株噬菌體裂解酶的相關研究報道更少見。2021年1月-2022年10月，我們篩選泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體，采用生物信息學方法預測泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列，進一步驗證泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂裂解酶的抗菌活性。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 MALDI-TOF-MS質譜儀靶版、CHCA基質液及ATS-335藥敏卡均購自法國梅里埃公司），CaCl（2天津市北辰方正試劑廠）、LB培養基（北京索萊寶公司）、一次性濾器（美國默克密理博公司）、溴化乙錠（美國賽默飛公司）、PCR反應試劑盒及DL15000 DNA marker（大連寶生物工程公司），瓊脂糖凝膠、DNA凝膠純化試劑盒、基因組提取試劑盒及質粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司），限制性內切酶、T4連接酶及卡那霉素（大連寶生物工程公司），Ni2+親和層析柱（美國GE公司）、PCR擴增引物、PCR擴增產物測序金唯智生物科技有限公司完成、電鏡圖片由杭州醫學院合作單位完成。MALDI-TOF-MS質譜儀、自動比濁儀及VITIK2 compact全自動微生物分析儀均購自法國梅里埃公司，CO2培養箱（美國Sheldon公司）、-80 ℃低溫冰箱（青島海爾公司）、電泳儀（北京六一電泳儀廠）、自動凝膠成像儀及電轉化儀（美國伯樂公司）、PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體的篩選 ①泛耐藥PA菌株的篩選（細菌藥物敏感實驗）：收集2016-2020年我院臨床分離保存的PA菌株237株，均經MALDI-TOF-MS質譜儀鑒定后保留。采用藥敏試驗，用比濁儀配制0.5麥氏濃度PA懸液，轉移至ATS-335藥敏測試卡，啟動VITIK2 compact全自動微生物分析儀觀察PA菌株對β-內酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環素類、磺胺類常用抗生素的耐藥性。最終篩選得到84株泛耐藥PA菌株。②泛耐藥PA菌株噬菌體的篩選（噬菌斑測定法）：采集天津市第一中心醫院污水處理站尚未消毒的污水樣本（噬菌體作為細菌病毒在污水中普遍存在［11］），0.1 g/L濃度加入CaCl2，10 000 g/min離心10 min除去固體雜質，收集上清，重復3次。取300 mL污水濾液，加入10株0.3 mL的泛耐藥PA菌株懸液，混勻后室溫靜置60 min，搖床180 r/min，37 ℃過夜培養。將混懸液加入47 ℃融化的0.7%瓊脂LB培養基2 mL，混勻后于固體LB平板鋪平，37 ℃過夜培養，培養24 h后觀察各培養基噬菌斑出現情況。有噬斑的培養基為存在泛耐藥PA菌株噬菌體的培養基，繼續培養增殖、純化后獲得泛耐藥PA噬菌體9株，噬菌體大小均一，噬菌斑明顯。③取9支EP管分別加入1麥氏濃度泛耐藥PA菌株懸液0.3 mL+0.3 mL的PA噬菌體原液，混勻后培養24 h后觀察噬菌斑出現情況。選取90%以上泛耐藥PA菌株均出現噬菌斑的噬菌體為泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體。

1.4 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因的獲取、序列確認

1.4.1 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因的獲取與測序 采用Proteinase K裂解法獲取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因，取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體，加入終濃度為 5 μg/mL 的 DNaseI及 1 μg/mL 的RNaseA，37 ℃溫育 1 h，降解宿主菌的 DNA和RNA。加入固體PEG8000至10%（w/v）冰浴1 h。4 ℃ 12 000 g/min 離心10 min后棄上清。采用基因組提取試劑盒提取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因序列，由金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.4.2 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列的確定 利用數據庫ORF finder和BLAST預測泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體基因開放閱讀框，使用RNAmmer和tRNAsan-SE軟件確定泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體的rRNA、tRN的基因序列，用NCBI數據庫中的BLASTN和BLASTP在線進行對比分析后，篩選得到泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶。

1.5 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶的獲取 、抗菌活性觀察

1.5.1 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶獲取 采用Primer premier5.0軟件根據泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列設計對應的引物進行PCR擴增。lysEPA19上游引物為CCGGAATTCATGACTGCYGATCAGG（529 bp），下 游 引 物 為 ATCAAGCTTTCATTGGTCACCACCC（529 bp）。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，終延伸 5 min，共40個循環。運用限制性內切酶酶切目的片段LysEPA19和質粒pET28a，T4連接酶連接目的片段和質粒，構建pET28a-LysEPA19重組質粒，對重組質粒進行測序以確定含有泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶基因序列，用重組質粒轉染大腸桿菌BL21，用含終濃度50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基培養，37 ℃ 培養至對數生長期，然后離心收集菌體，冰浴超聲波破碎，4 ℃低溫離心后取上清，用Ni-NTA親和層析純化，收集洗脫液，用SDS-PAGE電泳結果比對獲得蛋白分子質量與泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶。

1.5.2 泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶的抗菌活性觀察 取復蘇傳代的泛耐藥PA菌株菌液，將其均勻涂抹至2個培養基，在培養基中分別滴加5、10 μL的泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶，37 ℃ 培養24 h后觀察培養基上噬菌斑情況，如出現噬菌斑且越大說明抗菌效果越好。

2 結果

篩選得到泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體EPA19。提取泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體EPA19基因組。

對EPA19進行全基因組測序后預測開放閱讀框90個，最終比對發現噬菌體EPA19裂解酶所在位置（ORF54），并將其命名為Lys EPA19。成功純化得到Lys EPA19蛋白，SDS-PAGE電泳結果顯示Lys EPA19蛋白分子質量（27 kd）與目的蛋白相符。

培養泛24 h時加入5、10 μL的Lys EPA19培養基中均可見噬菌斑，且滴加10 μL的Lys EPA19培養基的噬菌斑大（見圖1），5 μL LysEPA19噬菌斑為11～13 mm，10 μL的 LysEPA19噬菌斑為23～27mm。

圖4 泛耐藥PA菌株加入Lys EPA19培養后噬菌斑生長情況

3 討論

PA具有易定植、易變異及復雜的耐藥機制，重癥患者感染PA后預后較差［12］。 鑒于PA感染的普遍性和嚴重程度，美國感染病學會已將其列為臨床六大最危險致病菌之一［13］。全國細菌耐藥監測數據［4］顯示，泛耐藥PA菌株逐年增多。本研究中泛耐藥PA菌株的檢出率為35.4%，與以往研究報道類似。因此噬菌體及其裂解酶的治療PA感染是目前的研究熱點。

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，其侵入細菌細胞內并產生酶破壞細胞壁從而裂解細菌。溶原性噬菌體和裂解性噬菌體［10］。前者是感染細菌后不增殖、不裂解細菌，而是將其核酸整合到細菌核酸上一起復制傳代；后者是在宿主細胞內復制增殖，產生許多子代噬菌體并控制編碼裂解酶最終使細菌裂解，也稱毒性噬菌體。它產生的裂解酶主要作用于水解細菌細胞壁上的聚糖骨架［14-15］。多數噬菌體裂解酶都具有“雙結構域結構”的特點，即N-端結構域具有催化活性，可以特異的切斷肽聚糖（peptidoglycan，PG）的化學鍵，也稱催化域 （catalytic domain）［16］。催化域中含有5種主要類型的酶活性：N-乙酰胞壁酶、轉糖苷酶、內-b-N-乙酰氨基葡糖苷酶、內肽酶或者N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。催化結構域主要作用于細胞壁上的聚糖骨架或者多肽鏈之間的酰胺鍵［17］，還有少部分作用于肽聚糖比如分支桿菌噬菌體裂解酶［6］。所以作為抗菌手段之一的噬菌體裂解酶的研究對臨床有重要價值而且還需要繼續深入的探討。

裂解酶作為極具潛力的抗生素替代物，它的高效、寬譜的裂解活性以及對理化因素的穩定性是實際應用的前提和基礎［8］。本研究以分離的耐藥PA廣譜噬菌體為材料，提取其基因組進行測序和分析。將噬菌體編碼的裂解酶通過克隆表達并誘導純化得到重組蛋白，本研究還測定了裂解酶lysEPA19的活性，結果發現其對泛耐藥銅綠假單胞菌有較好的裂解效果，為其未來應用提供了許多可能性，也同時為后續尋找新型噬菌體裂解酶以及探索裂解酶的機制奠定一定的理論基礎。

目前針對感染細菌注射裂解酶已有一些方面的研究，有幾種類型的注射已被證明其在動物模型中有效［18-21］。 ENTENZA等關注靜脈內注射裂解酶的研究動物實驗取得了一定效果。ADEL ABOUHMAD等［20］將T4裂解酶與纖維素融合模塊用于將裂解酶固定在纖維素紗布材料上，該傷口敷料具有抗革蘭陽性菌的活性，同時進一步增強了敷料抗血管生成作用和保質期。SCHUCH等［21］測試的金黃色葡萄球菌菌株（包括MRSA分離株） 噬菌體裂解酶抗菌活性，其結果發現裂解酶能明顯提高患葡萄球菌性菌血癥小鼠的存活率。BLAS BLAZQUEZ則利用鏈球菌噬菌體裂解酶有效控制肺炎鏈球菌的生長［22］。除了針對革蘭氏陽性菌以外， LOOD等［23-24］學者對革蘭氏陰性菌裂解酶也取得了一些進展，尤其是在耐藥鮑曼不動菌裂解酶的研究進展明顯。我國學者［25-26］均成功篩選出PA噬菌體裂解酶，并進一步驗證其有效性。

本研究基于國內外對噬菌體裂解酶的研究，展開針對泛耐藥PA菌株噬菌體裂解酶抗菌的嘗試，成功篩選并表達出泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶lysEPA19，并完成其活性驗證，達到預期效果。但本實驗中也存在不足，第一，未做動物實驗驗證泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體裂解酶蛋白lysEPA19活性，第二，未對lysEPA19蛋白進行加工修飾，探討其成為治療藥物的可能性。天然裂解酶都為窄譜裂解酶，在實際實驗過程中我們已經篩選出相對廣譜的裂解酶，但若繼續擴寬抗菌譜則需在蛋白層面對裂解酶進行修飾，以擴寬裂菌譜和降低不良反應，并且裂解酶lysEPA19與抗生素聯用的協同抗菌性以及裂解酶的長時間殺菌活性也亟待進一步研究，以期達到臨床使用的要求，為抗耐藥銅綠假單胞菌治療提供新的手段。

綜上所述，成功篩選出泛耐藥PA菌株廣譜噬菌體EPA19及裂解酶Lys EPA19。Lys EPA19可有效抑制泛耐藥PA菌株的生長。