經典瞬時感受器電位通道對內皮細胞和平滑肌細胞增殖所引起的阻塞性病變的影響

閆文麗，唐學義，張曉宇

1.安陽市第六人民醫院呼吸危重癥科，河南 安陽 455000；

2.河南省人民醫院·鄭州大學人民醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 鄭州 450003

在全球每年死亡人數中，心血管疾病占1/3，我國心血管疾病死亡率也居高不下［1］。動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中及心肌梗死等心血管疾病的發病基礎。怎么預防及治療心血管疾病，是目前醫學研究的熱點。深入研究動脈粥樣硬化的發病機制及探索其靶點非常重要。經典瞬時感受器電位通道（TRPC）是Ca2+身體性非選擇性的陽離子通道，TRPC6能介導受體操縱的鈣流入，表達參與疾病的發生、發展，尤其在心血管相關疾病的病理過程中有著重要作用［2］。本研究就TRPC對內皮細胞和平滑肌細胞增殖所引起的阻塞性病變的影響進行了探討，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 人體實驗 選取尸檢標本進行研究，尸檢標本選擇生前患有高血壓及腦血管疾病者。此次檢測方案經醫院倫理委員會批準通過。尸檢標本的尸解經其家屬同意后實行。

1.1.2 動物實驗 周齡為6周的、購于北京維通利華公司的ApoE -/-小鼠為模型組，經高脂飼料喂養2周；購于空軍軍醫大中心的C57BL/6J小鼠為對照組，經普通飼料喂養12 周。ApoE -/-小鼠經C57BL/6J 小鼠回交10 代以上做基因敲除。

1.2 方法

1.2.1 經免疫組織化學法檢測頸動脈斑塊中TRPC6 表達取頸動脈分叉位置，血管壁出現動脈粥樣硬化明顯的斑塊組織進行檢測，并取其周圍血管壁病變不明顯的組織為對照組。去除殘留血液、石蠟包埋；制作切片；烘箱融化石蠟、甲苯、梯度乙醇水化；抗原修復；透膜、內源過氧化氫酶滅活；封閉；孵育；顯色；蘇木素染色液復染；脫水等處理后，樹膠封片，顯微鏡拍照，取5個視野經分析圖像計算平均光密度，取均值。

1.2.2 小鼠建模后于其腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉 將胸腹腔打開，灌注3～4 mL 生理鹽水至左心室至肝臟發白，隨脊柱分離主動脈，一起剪下心臟，放入PBS 緩沖液干粉，顯微鏡下剝離心臟和血管組織，沿主動脈根部剪下心臟，縱向剖開主動脈為Y 型。把主動脈放入4%多聚甲醛中24 h、油紅O 染液浸染4 h，再用異丙醇分化多次至動脈粥樣硬化斑塊為紅色、動脈壁為白色。經蒸餾水沖洗后拍照，經Image-Pro Plus 6.0統計整個主動脈面積中的斑塊面積占比。另外經免疫組織化學法檢測小鼠主動脈的動脈粥樣硬化斑塊中的TRPC6 表達。基因敲除后，經CD68 免疫組織化學染色法檢測小鼠主動脈的動脈粥樣硬化斑塊中平滑肌細胞含量，經天狼猩紅染色法檢測動脈粥樣硬化斑塊中的膠原纖維含量。采用超聲影像技術檢測小鼠的頸部總動脈情況。

1.3 觀察指標

（1）TRPC6 在頸動脈動脈粥樣硬化中的表達情況。（2）高脂飼養下的動脈粥樣硬化形成情況。（3）TRPC6在小鼠主動脈動脈粥樣硬化中的表達情況。（4）基因敲除后，動脈動脈粥樣硬化斑塊中的平滑肌細胞及膠原纖維含量情況。（5）基因敲除后，血管壁增厚及血流阻力情況。

2 結果

2.1 石蠟切片中的IHC染色結果

動脈粥樣硬化不明顯的血管中，其血管內膜及中膜上均有TRPC6表達。而有明顯動脈粥樣硬化的血管中，血管形態破壞改變，中膜變薄，血管內斑塊組織較多，TRPC6表達顯著更高。經Image-Pro Plus6.0 計算IHC 陽性染色平均光密度值顯示，動脈粥樣硬化血管發生明顯的平均光密度為（0.006±0.001），未有明顯動脈粥樣硬化平均光密度為（0.041±0.012），動脈粥樣硬化血管發生明顯的顯著更高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 高脂飼料喂養的小鼠

經高脂飼料喂養12周后的小鼠動脈上出現明顯的動脈粥樣硬化斑塊。說明高脂飼料喂養12 周后的小鼠建模成功。

2.3 IHC檢測結果

經IHC檢測法顯示，對照組小鼠血管壁上的TRPC6表達弱，模型組動脈粥樣硬化斑塊有明顯的TRPC6 陽性顯示。經軟件統計其陽性染色平均光密度值，模型組（0.004±0.010）高于對照組（0.063±0.012），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 基因敲除后結果

對小鼠進行基因敲除后，經CD68 抗體免疫染色評價出其巨噬細胞含量，經α-SMA評價平滑肌細胞含量，經天狼猩紅染色評價膠原纖維含量。巨噬細胞增多，平滑肌細胞、膠原纖維減少會提高動脈粥樣硬化斑塊易損性。模型小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞含量（16.55±1.12）顯著少于對照組（28.21±2.23），差異有統計學意義（P＜0.05）；平滑肌細胞（27.26±2.51）顯著高于對照組（20.92±1.61），差異有統計學意義（P＜0.05）；而膠原纖維差異不明顯。結果提示，基因敲除后，動脈粥樣硬化小鼠的斑塊穩定性更高。

2.5 常規喂養的小鼠

常規喂養的小鼠頸動脈血管舒張內徑、血管收縮內徑、血管壁厚度、血流阻力指數無明顯的差異。高脂飼料喂養小鼠的動脈血管舒張內徑、血管收縮內徑有明顯的縮小，血管壁厚度有明顯增厚，血流阻力指數有明顯升高，表明造模會引起頸動脈血管功能障礙。基因敲除后小鼠和高脂小鼠比較，頸動脈血管舒張內徑從（0.43±0.03）mm增大到（0.53±0.01） mm，差異有統計學意義（P＜0.05）；血管收縮內徑從（0.36±0.02）mm 增大到（0.45±0.02）mm，差異有統計學意義（P＜0.05）；血管壁厚度從（0.012±0.012）mm 減小到（0.085±0.002）mm，差異有統計學意義（P＜0.05）；血流阻力指數從（0.890±0.012）mm降到（0.760±0.001） mm，差異有統計學意義（P＜0.05）。表明基因敲除后，能明顯改善血管壁增厚及血流阻力情況。

3 討論

長久以來，研究中針對動脈粥樣硬化提出了多種病理相關學說，包括：炎癥、損傷反應、內皮功能紊亂、血栓形成等眾多學說［3］。目前對動脈粥樣硬化病理學特征較統一的看法是膽固醇及急速的血湍流刺激動脈血管造成血管的內皮出現不同程度的損傷，大量的脂蛋白蓄積在內皮下，堆積成了脂紋。外周單核細胞經黏附、分化作用，形成了巨噬細胞，吸收脂蛋白產生了泡沫性細胞。而內皮細胞的活化性及大量細胞生長因子，對平滑肌產生刺激增生，且細胞外基質出現斑塊，其內的細胞凋亡壞死［4］。

瞬時受體電位TRP初始應用于1969年Manning對果蠅光轉導突變體的研究中，光刺激影響果蠅突變體產生瞬時鈣濃度增加，并出現電位反應［5］。其分為7 個亞家族，TRPC 是其中一個類似的蛋白家族，而TRPC 有7 個亞型，TRPC1-TRPC7，每個亞型都有6個跨膜區，5、6跨膜區間有孔環結構，每4個成員可組成同源及異源四聚體，構成TRPC 通道。TRPC1 常表達在哺乳動作組織中；TRPC2 是人類假基因，表達于大鼠犁鼻器官及小鼠精子頭部神經元微絨毛中；TRPC3表達于腦、卵巢、肺、腸、胎盤及睪丸中；TRPC5常表達于腦中；TRPC6多表達在肺中，其次是腦、卵巢、肌肉、胎盤中；TRPC7 表達在腦、肺、心、眼、睪丸中。TRPC 主要的激活方式有兩種，即受體操縱和庫操縱鈣內流，以引起鈣濃度變化。受體操縱中，G蛋白偶聯受體及受體酪氨酸激酶受外源性刺激，募集磷脂酶C、水解磷脂酰肌醇、二磷酸，產生肌醇、二酰甘油、三磷酸，經結合后引起鈣釋放進入胞漿。DA直接激活TRPC引起細胞外鈣內流。庫操縱鈣內流中，細胞內鈣庫耗竭使內質網膜的STIM1 和細胞膜上Oriall 偶聯，激活TRPC 通道，促使外鈣出現內流。臨床上大多研究均顯示，TRPC參與了人體中樞神經系統疾病、呼吸系統疾病及心血管系統疾病等多系統疾病的發生、發展過程。

本文通過對尸檢標本進行研究，提示TRPC6參與了動脈粥樣硬化的病理過程。有臨床研究指出，TRPC-1 及TRPG-6 在低氧誘導肺動脈平滑肌細胞內有Ca2+升高現象，對肺動脈血管的重建有重要的作用。研究還指出，低氧3 周會增強肺動脈高壓的大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC-l、TRPC-6表達，細胞外Ca2+通過TRPC通道使細胞內流增加，升高細胞內的Ca2+［6］。而動脈粥樣硬化明顯的斑塊組織中成分較復雜，包括巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞。其中內皮細胞及平滑肌細胞在動脈粥樣硬化發生及發展各階段均有重要作用。對小鼠建模的進一步研究顯示，高脂飼養的小鼠動脈粥樣硬化發生及發展迅速，可誘導動脈粥樣硬化斑塊形成。小鼠的主動脈進行TRPC6免疫組織化學法，發現其動脈粥樣硬化斑塊中的TRPC6表達上升，與人頸動脈的斑塊組織檢測結果一致。結果說明，尸檢和小鼠組織實驗均顯示TRPC6參與了動脈粥樣硬化的發生發展過程。另外，小鼠基因敲除后，動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞顯著減少，平滑肌細胞及膠原纖維明顯增多，使其斑塊穩定性更高。

內皮細胞是構成血管壁的主要細胞，動脈粥樣硬化的發生、發展過程中有血管內皮細胞凋亡的參與。內皮細胞與星形膠質細胞是心血管及中樞神經系統的組成部分，對其生理及病理功能作用較大。血管內皮細胞具體是指血管內膜表面細胞，連續覆蓋整個血管腔表面扁平細胞，是功能性界面，處于血液及組織分界面。參與血管收縮、舒張、凝血、血管生成、動脈硬化、炎癥的病理過程。有研究顯示，TRPC-7 干擾對人臍靜脈內皮細胞表達。可增加細胞的繁殖及遷移，對高糖引起的內皮損傷起到了一定保護作用［7］。提示TRPC-7 參與了血管內皮生理及病理過程。內皮細胞不僅能起到機械屏障及信息傳遞作用，還可合成分泌血脂活性物質以調節血管環境，使其保持穩定的收縮舒張，抑制平滑肌遷移及增生，保持血栓形成及纖溶蛋白溶解平衡。血管內皮細胞受損后，分泌炎性因子，誘導單細胞核黏于表面，浸潤到內皮下間隙。延遲的內皮細胞覆蓋功能缺失，不僅促成了血管內形成粥樣硬化斑塊，也是血管不良修復反應的主要原因。部分早期研究中顯示，人肺臍動脈、皮膚微血管及大鼠肺動脈內皮細胞中均有TRPC 表達。研究說明TRPC 參與了血管內皮細胞通透性及凋亡過程。血管內皮具有血液流動和溶質經半通透性血管內皮層的調節功能。如血管出現炎癥，會誘導內皮細胞形態出現改變及收縮，促使內皮的通透性程度。TRPC本身具有調節鈣離子流的作用，對血管內皮細胞通透性產生著影響。人肺動脈內皮細胞經TNF-α處理后，其TRPC表達上調。TNF-α刺激肺動脈、皮膚微血管內皮細胞，能顯著加倍提高凝血酶誘導的鈣離子內流。同時，肌動蛋白張力絲形成和跨內皮單層電阻也會增加內皮通透性。而皮膚微血管內皮細胞受TNF-α刺激影響TRPC 表達，內皮屏障出現障礙，與TRPC 對鈣離子內流調節時影響細胞形態有關。因此，TRPC 的表達水平高低是內皮細胞通透性信號表達的重要影響因素。TRPC 參與內皮細胞凋亡調節，內皮細胞凋亡過大，會影響其生物學功能。NF-KB信號誘導內皮細胞表達，加速炎性、抗凋亡基因， RNA 抑制TRPC 表達，并影響凝血酶誘導鈣離子的內流情況，避免激活NF-KB。有研究顯示，受TRPC基因干擾后，凝血酶誘導內皮細胞凋亡為25%［8］。且經基因微點陣分析顯示，內皮細胞凝血酶誘導表達NF-KB 調節基因呈多倍增加，其中A20抗凋亡基因表達最高。

血管平滑肌細胞是血管重要成分，起著血管活性及構型的重要作用。血管平滑肌細胞增殖對動脈粥樣硬化、高血壓等血管疾病形成機制有著重要作用。在肺動脈高壓患者和動物模型中，其血管平滑肌細胞膜TRPC6表達顯著升高，并促進平滑肌細胞膜的增殖及侵襲。提示TRPC6可促進平滑肌細胞膜，對肺動脈高壓的發生發展起著重要作用，平滑肌細胞增殖及凋亡出現失衡，細胞基質分泌使細胞、生長因子介導血管的再塑，是造成肺動脈高壓的主要原因。增殖和凋亡是相互對立制約的，兩者一起維護著機體組織器官各結構的穩定，一旦受多種內外因素影響打破，會引起組織器官的增生、萎縮、重構等病理現象。平滑肌細胞正常狀態下是靜止的非增殖狀態，起著調節血管張力的作用，胞質內有豐富肌絲。血管內皮細胞損傷使胰島素類生長因子、生長調解素、內皮衍生因子表達激活。上調平滑肌細胞增殖信號，下調抑制增殖信號，使其基因表達改變，改變中膜平滑肌細胞結構和功能，進入內膜發生增殖，分泌細胞外基質，減少胞內肌絲，平滑肌過度增殖，使其增殖與凋亡內在平衡消失，進而刺激動脈收縮及狹窄，引起病理癥狀。本研究結果顯示，基因敲除后小鼠與高脂小鼠比較，頸動脈血管舒張內徑、血管收縮內徑有明顯增大，血管壁厚度和血流阻力指數有明顯減小。說明TRPC6 基因敲除后，能明顯改善血管壁增厚及血流阻力情況。

綜上所述，TRPC6通過內皮細胞和平滑肌細胞增殖參與了動脈粥樣硬化的病理發生、發展全過程，是其潛在的干預靶點，可對此進行深入研究。