PLT-F通道在異常血小板計數檢測中的應用進展

史東沙 綜述,胡志東 審校

天津醫科大學總醫院醫學檢驗科，天津 300052

準確的血小板計數對于出血和血栓形成的風險評估、輸血決策和惡性血液病的診斷至關重要[1]。目前，全自動血細胞分析儀用于血小板計數檢測的準確性仍然飽受爭議[2]。在非常低值血小板計數中、存在類似血小板大小粒子干擾的標本及存在異常血小板聚集的標本中，血小板計數的準確性受到挑戰。為解決這些問題，血小板特異性單抗(抗CD61、抗CD41)標記技術及多參數的流式細胞術發展起來，然而由于價格昂貴，操作繁瑣并沒有應用到臨床，而是發展為了國際血液學標準化委員會推薦的國際參考方法(IRM)[3]。第二代的光學法血小板計數(PLT-O)可以準確檢測大部分的血標本，然而一些低值血小板標本及含有巨大血小板標本中，該系統對于血小板計數檢測依然不準確[4]。基于以上原因，熒光血小板(PLT-F)通道應運而生。通過PLT-F通道計數血小板時，血小板用熒光惡嗪染料染色，這種染料與富含核酸的血小板細胞器(如核糖體和線粒體)特異性結合，然后用半導體激光束照射血小板，將血小板的前向散射光和側向熒光強度繪制在二維散射圖上，進行血小板的鑒別和計數[5]。有關影響血小板計數檢測準確性的因素主要包括以下兩個方面。(1)血小板數量的異常，極低值血小板計數及異常高值血小板計數均會對血細胞分析儀檢測血小板計數的準確性提出挑戰；(2)各種干擾因素的存在，其中包括血小板計數假性增加的幾種情況：紅細胞碎片、白細胞胞質碎片、冷球蛋白、脂質及細菌/真菌干擾；血小板計數假性減少的情況：大血小板、血小板聚集和血小板衛星現象。本文將對PLT-F通道在異常血小板計數檢測中的應用做一綜述，以指導臨床實驗室測得更為準確的血小板計數。

1 血小板數量異常

1.1PLT-F通道用于低值血小板計數的檢測 PLT-F通道對于低值血小板計數的檢測是非常出色的，同時測量熒光和散射光使PLT-F通道能更精準的識別血小板，從而得到更準確的血小板計數[6]。激光共聚焦顯微鏡下，PLT-F通道結果與參考單抗抗CD61和抗CD41的著色特異性高度吻合，而該試劑對血小板膜和紅細胞碎片的薄膜均為弱著色，這一點明顯優于PLT-O通道[4]。PLT-F通道的分析標本量約為常規方法的5倍，即使血小板計數較低的標本，也可獲得高精度的數據[5]。PLT-F通道計數血小板的基本性能在批內重復性、線性和相關性方面均令人滿意，與IRM的相關性也非常高(r>0.99)。且PLT-F通道在確定患者是否需要輸注血小板方面效果是出色的，PLT-F通道在檢測血小板計數為10×109/L和20×109/L的靈敏度分別為95.8%和98.2%，遠高于PLT-I通道[7-8]。TANTANATE等[9]報道在急性白血病患者中相對于PLT-I通道及貝克曼庫爾特LH780血細胞分析儀，PLT-F通道在低值血小板計數檢測中的平均偏差最小，為 2×109/L。一些研究證實相對PLT-I通道，PLT-F通道的精密度和準確度均有提高[10-11]；也有研究報道，PLT-F通道表現出可接受的不精密度(<4%),尤其是在低值標本中，但是相比于PLT-I通道并沒有顯著降低[7]。多項研究評估了PLT-F通道在準確檢測低值血小板方面的性能[3,11- 12]，這些研究報道，PLT-F通道是一種可靠的低值血小板計數方法，是血小板減少患者合理選擇血小板輸注的首選方法。因此，對于血小板減少患者，尤其是血小板計數在血小板輸注閾值附近的患者，推薦采用PLT-F通道來檢測血小板計數。

1.2PLT-F通道用于異常高值血小板計數的檢測 血小板計數連續兩次大于450×109/L時通常被認為是血小板增多，血小板增多是醫學實驗室中常見的現象[13]。準確檢測血小板增多對惡性血液病(如原發性血小板增多癥)的診斷和出血及血栓風險評估也很重要[14]。而PLT-F通道在血小板增多中的性能仍存在爭議。SUN等[15]研究顯示在血小板增多方面，PLT-F通道(r=0.831)與IRM的相關性低于PLT-I通道(r=0.960)，PLT-F和PLT-I通道數值均呈現低于IRM數值的趨勢，而TANTANATE等[16]發現，對于有血小板增多的標本，PLT-F與IRM的符合率為98%，高于PLT-I與IRM的符合率(89%) 。但二者的研究均顯示在檢測高值血小板計數方面，PLT-F通道的特異度高于PLT-I通道，而靈敏度低于PLT-I通道。而文獻[11]評估顯示，PLT-F通道在檢測高值血小板計數方面，靈敏度和特異度均高于PLT-I通道，且二者檢測的血小板計數均高于IRM檢測的血小板計數。故PLT-F通道在血小板增多標本中的作用并沒有在血小板減少中那么優越，目前研究比較一致的是其檢測出血小板增多的特異度優于PLT-I通道，而靈敏度是否優于PLT-I通道仍有待更多的臨床研究證實，PLT-F通道檢測血小板計數高于還是低于IRM檢測結果的說法也不一致，故臨床實踐中，對于血小板增多標本，是否采用PLT-F通道復查有待商榷，而更應該做的是血涂片染色鏡檢，排除干擾因素導致假性血小板增多的可能。

2 各種干擾因素

2.1血小板計數假性增加

2.1.1紅細胞碎片和小紅細胞干擾 PLT-F通道采用熒光惡嗪染料對RNA染色結合流式細胞技術進行分析，血小板的熒光強度較高，可與小紅細胞和紅細胞碎片區分開來。在平均紅細胞體積小于65 fL的小紅細胞標本中，PLT-F通道仍能得出準確的血小板計數[17]。人工制備破碎的紅細胞，按比例加入純富血小板血漿上機檢測，結果顯示在混有紅細胞碎片的標本中，PLT-F通道仍可以得到較為準確的血小板計數，明顯優于PLT-I和PLT-O 通道[4]。對于燒傷患者血小板計數變化的監測顯示，在燒傷發生的前3天，由于紅細胞碎片的存在，PLT-I和PLT-O通道檢測的血小板計數與IRM檢測的結果有很大差別，而PLT-F通道檢測到的血小板計數與IRM檢測的結果始終一致[2]。在富含小紅細胞和紅細胞碎片的珠蛋白生成障礙性貧血患者中，PLT-F通道也與IRM有良好的相關性[16]。另外有多篇病例報告顯示，在臨床實踐中，PLT-F通道可有效糾正紅細胞碎片和小紅細胞的干擾，在正常紅細胞散點的下方出現弱側向散射光和較強前向散射光的碎片紅細胞散點區域，其中包括珠蛋白生成障礙性貧血患者極小紅細胞干擾,以及彌散性血管內凝血患者、骨髓纖維化患者紅細胞碎片干擾[18-20]。故對于存在小紅細胞和紅細胞碎片的標本，PLT-F可以作為反射試驗，以獲得相對準確的血小板計數。

2.1.2有核細胞胞質碎片 除了紅細胞外，有研究報道一些異常細胞的胞質碎片也會導致血小板計數假性增加，這些幾乎都是由原始細胞或淋巴瘤細胞產生的小碎片[21]。類似于紅細胞碎片，當大量出現時，它們有時可以使血小板計數假性增加。單核細胞白血病和彌漫大B細胞淋巴瘤是這種罕見干擾最常見的原因[22]。急性白血病時，原始細胞的存在是干擾阻抗法血小板計數的獨立因素，這種干擾可能與原始細胞產生的胞質碎片有關，而PLT-F通道檢測的血小板計數更接近IRM的結果[9]。然而值得注意的是在白血病患者標本中，原始細胞胞質碎片的干擾導致的結果很少是血小板計數增多，更常見的情況是，它們掩蓋或部分糾正了血小板計數減少，從而延遲了血小板輸注。當有出血，但血小板計數沒有下降時，臨床和實驗室醫生均應警惕這種假設的存在。TANAKA等[5]對兩例存在白細胞碎片的白血病病例分析顯示：在PLT-F通道散點圖中，白細胞碎片在高熒光強度的未成熟血小板 (IPF)區域上方被視為一個異常的簇，該簇被識別為白細胞，IPF區未被侵入。PLT-F通道檢測的血小板計數略低于IRM的結果，并沒有發現白細胞碎片的對血小板計數的影響。XN分析儀的結果通常產生其他報警信息(如懷疑大血小板或血小板團)或有關設備無法產生擬合曲線。在阻抗和光學衍射技術中，血小板計數都是扭曲的，PLT-F通道測量更準確[23]。故對于懷疑存在有核細胞胞質碎片干擾標本，PLT-F通道是合適檢測血小板計數的方法。

2.1.3其他 冷球蛋白會干擾血細胞計數，并且它們的干擾是大小相關的，小的沉淀物會誘發假性血小板增多或掩蓋血小板減少[24-25]。PLT-F通道采用了對血小板RNA染色更精準的熒光染料，可以有效對抗冷球蛋白的干擾，得出正確的血小板計數[23]。PLT-F通道用于測定脂血標本中的血小板計數是可靠的。在含不同水平血小板的非脂血全血標本中各加入400 μL脂肪乳置換等量血漿上機檢測，結果顯示僅PLT-F通道在高、中、低組中均符合預設的均值偏倚、比例偏倚和截距的95%CI標準。與PLT-I或PLT-O通道相比，PLT-F通道能更準確地反映脂血標本的真實血小板計數[26]。故對于脂血標本及懷疑冷球蛋白干擾標本推薦采用PLT-F通道計數血小板。由于本身比較罕見，有關細菌、真菌干擾對PLT-F通道的影響的鮮有報道。

2.2血小板計數假性減少

2.2.1大血小板 無論是否存在血小板減少癥(骨髓增生性腫瘤、骨髓增生異常綜合征、遺傳性血小板疾病和/或血小板減少癥、免疫性血小板減少癥等)，在各種情況下均可發現大血小板甚至巨血小板，并常常導致血小板計數被低估，甚至干擾白細胞計數[23,27]。它們的檢測對于糾正血小板計數和指導原發性血小板減少癥的診斷具有重要意義。相比于PLT-I和PLT-O通道，PLT-F通道可以通過特異性染色血小板內RNA更精準的識別大血小板，從而得出更準確的血小板計數[23]。在PLT-F通道的血小板散點圖上，大血小板常常出現在正常血小板的右上方的綠色區域，被識別為IPF，可以和紅細胞和白細胞明顯的區分開來[3]。在存在大血小板的標本中，PLT-F通道與手工法有較好的一致性[28]。大血小板存在時，XN分析儀通常會有“大血小板”的報警提示，同時血小板直方圖會出現翹尾現象，應提高警惕，并及時采用PLT-F通道進行復測。

2.2.2乙二胺四乙酸(EDTA)誘導的血小板聚集及血小板衛星現象 EDTA誘導的血小板聚集在臨床并不少見，然而直至2020年仍有病例報道由于EDTA誘導的假性血小板減少導致的不良臨床后果[29-30]，其中包括新型冠狀病毒感染患者EDTA誘導血小板假性減少導致的不必要的血小板輸注[31]。PLT-F通道在血小板聚集的識別和處理方面的價值均有報道。LUNDE等[32]報道，PLT-F通道用于鑒定EDTA誘導的假性血小板減少的診斷準確性非常好，可有效識別血小板聚集，明顯優于WDF和WNR通道。 LARDINOIS等[33]最近有關1例多種抗凝劑聚集的病例報道認為，PLT-F、PLT-O通道和IRM可使聚集物部分分離，因而檢測得到的血小板計數的最高，而阻抗法是最容易導致血小板聚集的方法。考慮到IRM的技術和時間成本較高，PLT-O通道的變異性較大，熒光血小板計數是最有用的二線技術。光學血小板計數可以使EDTA誘導血小板聚集現象部分解離這一現象也在有些研究中報道，例如Mindray SF-cube平臺上加入渦旋技術后采用PLT-O通道可以有效地糾正EDTA誘導的血小板聚集，甚至提出EDTA誘導的血小板聚集可能不再需要另一種抗凝劑[34-35]。盡管如此，更換抗凝劑如檸檬酸鈉或肝素采血管仍是目前臨床解決這種現象最常用的方法[36]，其他報道的方法包括渦旋混勻[37]，機器旁采血立即上機檢測[38]，37 ℃保溫上機檢測或者是標本中加入阿米卡星、氯化鈣、抗血小板藥物、疊氮化鉀、卡那霉素或其他氨基糖苷[23,39-41]。血小板衛星現象由于臨床比較罕見，有關其對PLT-F通道的影響的鮮有報道。

綜上所述，在低值血小板計數檢測和血小板輸注指導方面，PLT-F通道表現出了出色的性能，且可有效糾正紅細胞碎片、有核細胞胞質碎片、冷球蛋白、脂質和大血小板對血小板計數的干擾。因此，PLT-F法血小板計數有助于形成更合理的臨床決策，并有助于血液學或臨床實驗室的高效運作[5]。但與常規阻抗法相比，PLT-F通道需要更大的標本體積和更長的計數時間，以及更高的熒光細胞染料成本。因此，不能將PLT-F通道作為每種情況的初始試驗。它更適用于作為一個反射試驗用于懷疑阻抗法計數不準確的標本。另外由于RNA在室溫放置下會降解，因此 PLT-F 通道更適合于新鮮全血的應用[11]。對于血小板增多標本，PLT-F通道并沒有表現出明顯優勢。而EDTA誘導的血小板聚集現象仍是目前影響血細胞分析儀血小板計數準確性的一大挑戰，渦旋混勻結合熒光流式血小板計數或許是未來血細胞分析儀的破局方向。