心肌梗死相關miRNA-mRNA調控網絡及其作用

王雯雯，延偉偉，莫霄云

1 廣西中醫藥大學第一臨床醫學院，南寧 530299；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院心血管內科

隨著人們生活方式的改變，心血管疾病的發生率和病死率不斷上升，目前心血管疾病在我國所有疾病中的病死率高居首位［1］。心肌梗死（MI）是指冠狀動脈發生的一種心肌缺血性壞死疾病，且MI能夠誘發心源性休克、心房顫動、心力衰竭等［2］，嚴重威脅患者的健康。目前臨床對于MI 的治療仍以藥物治療及手術治療為主，但隨著對MI發病機制深入研究發現，通過抗血小板聚集、再灌注治療及溶栓、取栓、血管重建術等改善心肌缺血及心室重構，可有效緩解疾病的進展［3］。盡管如此，MI 的病死率仍不斷上升［4］，預計到2030 年我國將有3 000 萬MI 患者［1］。生物信息學通過對生物醫藥領域的信息進行收集、處理以及利用，進而從基因分子層面揭示疾病的發生機制及潛在規律。因此，本研究通過生物信息學對MI 中差異表達微小RNA（miRNA）和差異表達基因進行分析，并建立MI 的miRNA-mRNA 調控網絡，為MI的治療及其預防提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 MI患者miRNA數據集的選取 選擇基因表達數據庫（GEO， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds），檢索該數據庫2021年12月—2022年9月的數據，以“miocardial infarction”“miRNA”等為關鍵詞，通過勾選Homo sapiens（智人）種屬和Non-coding RNA profiling by array 研究類型，共檢索到234 篇有關MI 的文獻；根據其是否具有樣本獨立性、組間可比性、樣本類型等標準最終篩選得到GSE61741 基因表達譜，包含外周血樣本（MI患者樣本62例、正常人樣本94 例）的miRNA 微陣列數據集，該平臺芯片為GPL9040（febit Homo Sapiens miRBase13.0）。本研究以62 例MI 疾病樣本作為MI 疾病組，62 例正常人樣本作為正常組。

1.2 差異表達miRNA 的篩選 用Perl 軟件對miRNA 基因表達譜原始數據集進行基因重注釋，并用R語言對其進行校正、分類，用limma包對miRNA數據進行差異分析，篩選標準設置為：P＜0.05，|logFC|＞1。用pheatmap 包根據篩選出來的差異miRNA 繪制熱圖和火山圖。

1.3 差異表達miRNA 下游靶基因預測 用miRNet（https：//www.mirnet.ca/miRNet/upload/MirUpload-View. xhtml）在線網站分析miRNA-mRNA 的相互作用關系，對差異表達的miRNA 下游靶基因進行預測。

1.4 差異表達miRNA 上游結合轉錄因子預測 采用FunRich3.1.3 分析基因和蛋白質功能富集、相互作用網絡，預測在MI患者外周血中存在目標靶基因的差異表達miRNA 上游結合轉錄因子，在該軟件內分別輸入所獲取的差異表達miRNA，并取排名前10且具有意義的轉錄結合因子。

1.5 差異表達基因數據處理 采用GEO 數據庫獲取mRNA 數據集并對差異表達miRNA 的可靠性及其預測下游靶基因的真實性進行驗證。在GEO 數據庫中檢索“miocardial infarction”“mRNA”等關鍵詞，最終由GPL570 平臺｛［HG-U133_Plus_2］ Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array｝分析GSE66360 數據集。利用Perl 對mRNA 數據集進行基因重注釋，并利用R語言校正、分類，篩選標準：P＜0.05，|logFC|＞1。用limma 包對mRNA 數據集中的50 個正常組及49 個MI 疾病組進行差異分析，制作火山圖。

1.6 差異表達miRNA 下游目標基因的篩選 利用GEO 數據庫明確上述獲得的MI 疾病組與正常組樣本間的上、下調表達mRNA，并將上調表達miRNA與下調表達mRNA 取交集；將下調表達miRNA 與上調差異mRNA 取交集，從而得到差異表達miRNA 下游目標基因，最后繪制韋恩圖。

1.7 基因本體（GO）生物學功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 使用enrichplot包、clusterProfiler 包及DOSE 包，通過R 語言對MI 中差異表達miRNA 下游目標基因進行GO 生物學功能注釋及KEGG通路富集分析，其中GO包括生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）。

1.8 蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建及關鍵基因鑒定 采用String 數據庫，綜合得分≥0.4 的條件下構建PPI網絡。運用cytoscape3.9.1軟件的插件“cytohubba”進行網絡拓撲分析，并利用Degree 度、邊過濾成分、最大鄰居組件、BottleNeck 等四種不同算法分別篩選出PPI 網絡中排名前10 的關鍵基因，將不同算法的前10名基因取交集獲得Hub基因。

1.9 Hub 基因及關鍵miRNA 的預測 采用miRNet在線數據庫，將所獲取的Hub 基因導入即獲得相應miRNA，通過可視化呈現Hub 基因及相應miRNA 的網絡調控圖，通過綜合分析篩選出與Hub 基因相關性排名前5的miRNA。

2 結果

2.1 芯片數據集中的差異表達miRNA 共得到162 個差異表達miRNA，其中表達上調基因93 個、表達下調基因69個。

2.2 差異表達miRNA 的下游靶基因 得到在外周血中存在下游靶基因的17 個差異表達miRNA。其中4 個表達上調miRNA，分別為miR-19b-3p、miR-132-5p、miR-223-3p、miR-223；13 個表達下調miRNA，分 別 為miR-155-5p、miR-20a-5p、miR-21-5p、miR-455-3p、miR-33a-5p、miR-20a-3p、miR-33a-3p、miR-33b-3p、miR-155-3p、miR-21、miR-155、miR-20a、miR-33a。在miRNet 數據庫中，表達上、下調miRNA 各自含有2 105、7 991個對應的下游靶基因。表達上、下調miRNA-靶基因的調控網絡。

2.3 差異表達miRNA 的上游結合轉錄因子 通過FunRich（http：//www. funrich. org/）在線預測17 個差異表達miRNA 在外周血中的上游結合轉錄因子，取評分最高的前10 個轉錄因子。差異表達miRNA中4個表達上調基因的前10個轉錄因子分別為配對盒 基 因6（PAX6）、2 級POU 結 構 域 轉 錄 因 子1（POU2F1）、核受體亞家族6A 組成員1（NR6A1）、特異性蛋白1（SP1）、同源框A9（HOXA9）、前B 細胞白血病轉錄因子1（PBX1）、同源盒基因A13（HOXA13）、肌細胞增強因子2A（MEF2A）、胚胎外組織精子發生同源盒基因1（ESX1）、同源盒基因B13（HOXB13），其中PAX6、POU2F1、NR6A1、SP1 差異表達有統計學意義（P均＜0.05）。差異表達miRNA中13 個表達下調基因前10 個轉錄因子分別為SP4、早期生長反應因子1（EGR1）、POU2F1、SP1、SOX1、MEF2A、FOXA1、ras 反應元件結合蛋白1（RREB1）、FOXO1、HOXA3，差異表達均有統計學意義（P均＜0.05）。由于POU2F1、SP1 轉錄因子均與表達上、下調基因存在調控關系，故POU2F1、SP1 在此最為重要。

2.4 MI 差異表達基因 獲得289 個上調和62 個下調顯著差異表達mRNA。使用維恩圖對差異表達mRNA 及差異表達miRNA 所預測的下游靶基因取交集，可獲得表達上調miRNA 的靶向目標基因2個，下調的靶向目標基因163個。

2.5 GO 和KEGG 富集分析結果 GO 富集分析發現，目標基因的生物學過程主要與細菌來源分子的反應、對脂多糖的反應、細胞因子產生的正調節等相關；在細胞組分中主要富集在三級顆粒、富含纖膠凝蛋白1顆粒體、分泌顆粒腔等；在分子功能中主要富集在細胞因子活性、趨化因子活性、DNA 結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性等。KEGG 富集分析發現，目標基因主要在TNF 信號通路、IL-17 信號通路、NF-κB信號通路中顯著富集。

2.6 構建PPI網絡及Hub 基因的篩選 獲得居前7位Hub 基因：FOS、纖維連接蛋白1（FN1）、JUN、NFKBIA、腫瘤壞死因子（TNF）、趨化因子CXC 基序配體8（CXCL8）、IL-1β。

2.7 7 個Hub 基因與相關miRNA 的預測 通過綜合評價篩選出排名前5 的核心miRNA，分別為miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-129-2-3p、miR-24-3p。

3 討論

miRNA 作為表觀遺傳學的一種方式，在基因表達調控中起關鍵作用，但絕大多數miRNA-mRNA之間的相互作用并未完全闡明［5］。有研究發現，miRNA 能夠通過負向調控mRNA 的表達，進而降低因缺氧而導致的心肌細胞損傷，認為miRNA 可以作為診斷MI 的生物標志物［6］。但是，未進一步探究與MI 中的miRNA 分子機制，且MI 疾病發展過程中參與miRNA 介導的調控機制的分子網絡也尚未明確。因此，本研究從生物分子學角度出發，利用生物信息學挖掘出與MI 相關的調控基因及其相關miRNA，明確其分子機制，為防治MI 提供一定的理論依據。

在本研究中，通過分析miRNA 基因芯片數據集的差異表達情況，進而得到17 個具有異常表達的miRNA，其中表達上調miRNA 有4 個，表達下調miRNA 有13 個。miR-19b-3p 作為早期診斷MI 的重要指標，其在MI 患者血漿中處于高表達狀態［7］；MI患者血漿中miR-223-3p 的水平較健康人群明顯上升［8］；此外，miR-223 在MI 患者的血清中也存在高表達，其高表達可加速心肌細胞的凋亡［9］。研究表明，MI 患者血清中miR-21 的表達上升，能夠誘發心肌梗死的發生［10］；另有研究發現，miR-155-5p 表達下調可通過Cab39 /AMPK 信號通路，延緩人類間充質干細胞衰老，進而起到預防MI 的作用［11］。這與本研究結果有差異，可能由于標本采集的組織、部位及實驗室所選擇的方法不同造成的，仍需進一步探究。

miRNA 與結合轉錄因子之間可發生相互作用，miRNA 的表達受相關結合轉錄因子的支配，其也可以反作用于轉錄因子，二者聯合可調控下游mRNA的轉錄及翻譯，是細胞代謝的重要調節劑［12］。為此本研究通過預測差異表達miRNA 的相關結合轉錄因子，發現SP1作為轉錄因子，能夠參與生物細胞的生長分化、增殖、凋亡等基本生物學過程，其在調節心肌細胞生長凋亡及防治MI的作用得到了證實［13］。POU2F1 也被稱為八聚體結合轉錄因子1，是一種位于1q24 染色體上的重要轉錄因子；有研究發現當小鼠MI 組織中的POU2F1 高表達時，可促進心肌成纖維細胞分化，進而加重細胞外基質的硬度，導致MI發生［14］。EGR1 作為一種重要的轉錄因子，其在誘導細胞凋亡、調節細胞炎癥和干預心肌細胞纖維化中起到了關鍵作用；當EGR1 表達下調時，可降低心肌細胞中的炎癥因子的產生和細胞纖維化，因此下調EGR1 表達可能是治療MI 及其并發癥的一種防治手段［15］。

本研究通過對差異表達miRNA 及其下游差異表達mRNA 進行整合，得到miRNA 表達上調靶向目標基因2個和表達下調靶向目標基因163個。經GO功能注釋及KEGG 富集分析發現165 個目標基因主要富集在細菌來源分子的反應、三級顆粒、細胞因子活性等相關生物功能以及聚集在TNF、IL-17、NF-κB等信號通路中。TNF-α作為炎癥反應的重要調節因子，其誘導的信號通路在細胞對炎癥和損傷的反應中扮演了重要角色；炎癥免疫反應是MI 的誘因之一，而激活的TNF-α信號通路可以改善血管循環、緩解冠狀動脈硬化、修復心肌損傷和心臟重構，進而對MI 起到防治作用［16］。IL-17 是一種能夠以血管作為靶目標的炎癥細胞因子，其不僅可與相同細胞因子結合增加血小板聚集，增加血栓形成風險；而且可通過募集白細胞和活化內皮細胞，進而誘導心肌胞凋亡，加重心肌缺血和再灌注損傷程度，最后加快MI的發展進程［17］。心肌細胞的氧化應激反應及凋亡是MI發病后出現的病理變化，其嚴重程度可判斷MI的進展［6，18］。NF-κB 是一種具有多種轉錄功能的蛋白，其參與多種細胞活動；有研究發現，TLR4/NF-κB 信號通路在介導MI 的炎癥反應及細胞凋亡中發揮了關鍵作用，TLR4/NF-κB在MI心肌組織中呈高表達，當其信號通路激活時可加重心肌損傷；而使用氧化物酶2（Prdx2）蛋白抑制TLR4/NF-κB 信號通路時可降低心肌細胞的氧化應激和凋亡水平，起到治療MI的作用［18］。因此上述不同途徑均可成為MI 治療的潛在機制。

本研究進一步通過構建miRNA-mRNA 調控網絡，利用網絡拓撲分析，采用四種不同算法篩選出前10位目標基因，并取交集進而獲得7個Hub基因，分別為JUN、FOS、TNF。CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β。CXCL8 作為趨化因子家族中的一員，在心臟損傷、修復和重塑中起到關鍵介導作用，可通過募集白細胞及控制中心粒細胞浸潤進而減緩MI 所引發的炎癥反應［19］；FN1 參與了MI 誘導的心肌纖維化和炎癥反應，其在MI 患者的心肌組織中呈高表達，當使用FNI 拮抗劑劑后可有效改善MI 所導致的心肌細胞凋亡、炎癥及氧化應激反應［20］；NFKBIA 是NF-κB 的抑制劑，通過抑制NF-κB 信號通路激活，降低NF-κB在MI中的促炎作用，進而保護心肌［21］；IL-1β 是一種炎癥因子，在心血管疾病發生中起關鍵作用，MI 患者中使用IL-1β 抑制劑后，心血管不良事件發生率降低［22］。由此可見，CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β、TNF 參與MI 的發生發展過程，但目前尚未發現JUN、FOS、MI的相關文獻報道。

為進一步驗證MI 相關miRNA，根據篩出的7 個Hub 基因利用miRNet 在線數據庫對其有關miRNA進行預測，并取前5 位miRNA。目前對于miRNA 的相關研究與日俱增，但miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-24-3p 與MI 的報道并不多見。有研究發現，心肌缺血引起的缺氧是導致MI的重要原因，而miR-34a-5p過度表達會加重心肌缺氧的發生；通過構建缺氧MI 細胞模型，發現抑制miR-34a-5p表達可以保護心肌細胞免受缺氧損傷［23］。miRNA（包括miR-24-3p）在MI 中不同的表達及其對下游靶基因的作用影響著MI 的發生。有研究表明，miR-24-3p 在心肌缺血/再灌注中表達上調，其下游靶基因RIPK1 表達上調；RIPK1 高表達可增加心肌梗死面積，加速細胞凋亡，而miR-24-3p 可通過抑制RIPK1 表達進而保護受損心肌細胞［24］。此外亦有研究發現，miR-130a-3p 具有類似的調控效果，上調miR-130a-3p表達可抑制過度的心肌母細胞自噬并改善心肌缺血/再灌注損傷［25］。miR-129-2-3p在MI 中的調控作用經查閱相關文獻后并未見相關報道。

綜上所述，本研究成功構建了MI 相關的miRNA-mRNA 調控網絡，發現CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β、TNF 及其所對應的miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-24-3p 在MI 發生發展及其防治過程中發揮調控作用。本研究仍存在不足，如所篩選的基因芯片樣本數量不夠多，只進行了理論層面的分析，而未對MI調控網絡的體內外實驗進行驗證。