內皮型一氧化氮合酶與心肌缺血再灌注損傷的關系研究進展

魏娜，劉振兵，2

1 內蒙古醫科大學鄂爾多斯臨床醫學院，內蒙古 鄂爾多斯 017000；2 鄂爾多斯市中心醫院心血管內科二區

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指冠狀動脈（冠脈）血供減少或中斷后造成心肌缺血，待冠脈血運恢復后出現心肌頓抑導致不可逆損傷，導致心肌細胞凋亡或壞死。雖然在心肌缺血期間給予心臟保護干預措施（治療性低溫、迷走神經刺激、遠程缺血預適應和美托洛爾治療等）可減輕MIRI［1］，但療效有限，還需進一步研究心臟保護策略。內皮型一氧化氮合酶（eNOS）在心肌細胞和內皮細胞表達，可催化底物L-精氨酸生成一氧化氮（NO），發揮心臟保護作用。本文對eNOS與MIRI的關系進行綜述。

1 eNOS的來源、結構和功能

eNOS 是血管內皮中最重要的NO 合成酶亞型，是一種同源二聚體，可與多種輔因子結合，將L-精氨酸和氧氣轉化為L-瓜氨酸和NO。eNOS 的N 末端由加氧酶結構域組成，含有四氫生物蝶呤、血紅素鐵和L-精氨酸結合部位，以上輔因子可促進酶的二聚化。當L-精氨酸和四氫生物蝶呤缺乏時，eNOS不產生NO 而產生超氧陰離子（O2-），導致氧化應激和內皮功能障礙，最終加劇eNOS 解偶聯［2］。每個eNOS單體的兩個半胱氨酸殘基之間與鋅離子形成的硫代鋅簇使酶更穩定。但當該簇被氧化或暴露于過量過亞硝酸鹽中會導致eNOS解偶聯。eNOS與不對稱二甲基精氨酸（ADMA）會競爭底物精氨酸，所以ADMA 是內源性的eNOS 抑制物，當其血漿濃度的增加會使eNOS 解偶聯，促使氧化應激和內皮功能障礙發生和發展。然而在生理條件下或L-精氨酸充足的情況下不會發生。eNOS 的C 末端是還原酶結構域，可與黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結合。若要激活eNOS，需兩個鈣離子激活鈣調蛋白，解除其與還原酶結構域相連方可激活eNOS。

eNOS 不僅在內皮細胞中表達，并在心肌細胞、肥大細胞、腎上皮細胞、紅細胞、白細胞和血小板中表達，在心血管生理學中發揮混合功能，既可以合成NO，擴張血管，也可以合成超氧化物，加劇氧化應激。

2 eNOS生理作用與MIRI的關系

2.1 解偶聯 eNOS 解偶聯可加劇MIRI。偶聯時，eNOS 產生NO 以促進血液流動，并在血管內皮細胞表面維持抗炎和抗血栓的作用［3］。解偶聯時eNOS功能受損，即不生成NO，而是產生O2-，使NO 生物利用度降低，氧化應激增加，并導致或加重內皮功能障礙。抑制eNOS 解偶聯包括加入L-精氨酸底物、抑制精氨酸酶以及補充四氫生物蝶呤和葉酸，后者可提高NO 水平［2］。研究證實，在人臍靜脈內皮細胞缺氧復氧模型中減少eNOS 解偶聯可通過下調O2-和過氧亞硝基陰離子（ONOO-）的生成，提高NO 水平，改善缺氧/復氧誘導的內皮損傷和氧化應激。此外，氧化應激引起的氧化谷胱甘肽水平升高可誘導劑量依賴的eNOS S-谷胱甘肽基化產生，加劇解偶聯［3］。其次，解偶聯可將運動產生的有益的血管效應轉化為血管損傷的關鍵事件。在內皮腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1 缺乏的情況下，運動促進了eNOS 介導的超氧化物歧化酶的產生，過氧亞硝酸鹽的形成增加，導致活性氧大量生成，并使內皮功能障礙持續存在［4］。抗阻力運動可通過限制eNOS 解偶聯增強其活性，將NO 信號轉化為遠端缺血預處理效應，促進缺血后心肌收縮功能恢復，減少致命性心律失常，縮小心肌梗死面積［5］。綜上，eNOS 解偶聯會誘導氧化應激及內皮功能障礙加劇MIRI。

2.2 磷酸化 磷酸化是eNOS 活性的關鍵調節方式。eNOS 的磷酸化和去磷酸化依賴于鈣調蛋白的結合和電子從還原酶到加氧酶結構域的流動。eNOS 被磷酸化的主要部位是絲氨酸殘基（Ser），其次是酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）殘基。Ser617、635和1179 以及Tyr81 的磷酸化導致eNOS 激活，而Ser116 和Thr495、497、Ser144 的磷酸化會使eNOS 活性減弱［6］。MIRI 小鼠模型缺血心肌中亞硝酸鹽水平、eNOS 表達和Ser1177 處的磷酸化顯著減少［7］。與安靜大鼠相比，運動大鼠心臟中eNOS Ser1177 位的磷酸化在再灌注早期顯著降低，增加心臟對MIRI的易感性，發揮保護效應［4］。高密度脂蛋白通過增加eNOS Ser1177 磷酸化，增加eNOS 活性并保護血管彈性，進而減輕MIRI［8］。在細胞MIRI 模型中，增加Ser1177 和Tyr81 處磷酸化可促進eNOS 產生NO，從而減輕冠脈內皮功能障礙。遠端缺血適應可誘導Tyr81 磷酸化使MIRI 心肌中的eNOS 激活［9］。通心絡可增加缺血心肌eNOS Ser1179 和Ser635 處的磷酸化來減輕無復流和MIRI。缺血預處理顯著逆轉了MIRI誘導的eNOS Ser1177處磷酸化和總eNOS表達的降低，保護血管內皮。無機砷可增強男性eNOS Ser1177 磷酸化水平，減輕MIRI，而女性由于雌激素的內分泌干擾作用無此效應。所以eNOS 的有益磷酸化是確保NO 產生的關鍵翻譯后修飾，通過逆轉凋亡、保護血管內皮發揮保護作用。

3 eNOS與MIRI發病機制的關系

3.1 內皮功能障礙 血管內皮作為最直接暴露于MIRI外源性損傷的器官，MIRI可造成血管內皮功能障礙，使eNOS 蛋白表達嚴重降低，NO 產生減少。MIRI 發生后在冠脈血運重建時會進一步加劇內皮功能障礙［10］。血管內皮功能有大部分經eNOS 的功能和活性決定［8］，NO 不僅是血管擴張劑，也是減少血小板聚集和中性粒細胞黏附的抑制劑，只有通過維持足夠的eNOS水平才能改善MIRI引起的內皮功能障礙。沉默信息調節劑1（SIRT1）已被證明可與eNOS 結合，并使eNOS 鈣調蛋白結構域中的賴氨酸K496 和K506 去乙?；?，從而促進NO 的產生，重置eNOS 活性。動物實驗發現，eNOS 基因敲除的小鼠可導致嚴重的血管內皮細胞功能障礙，并導致冠心病［11］。第三代β1選擇性β受體阻滯劑奈比洛爾可刺激內皮NO 的形成，逆轉內皮功能障礙，改善高血壓大鼠模型的氧化應激，并防止心肌梗死的多種并發癥發生［12］。維生素D缺乏是內皮功能障礙的危險因素。在內皮細胞中，維生素D通過介導eNOS活性來調節NO 合成。在致病條件下，由于活性氧過量產生引起的氧化應激會促進NO 降解、抑制其合成并降低其生物利用度。維生素D抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，使活性氧產生受影響，并通過增強抗氧化酶的活性來提高抗氧化能力［13］。所以內皮功能障礙和eNOS 損傷會相互促進，無法起到擴血管和保護內皮作用，加劇MIRI。

3.2 氧化應激 MIRI 會誘導過量的活性氧物質形成造成氧化應激，后者可對eNOS本身或上下游信號分子中明確定義的“氧化還原開關”進行不利調節?！把趸€原開關”包括：四氫生物蝶呤的氧化耗竭，鋅硫絡合物的氧化破壞eNOS二聚體，活性氧引發的內源性eNOS抑制物ADMA水平的增加［14］，還原酶區域半胱氨酸殘基Cys689 和Cys908 上的S-谷胱甘肽基化［15］，以及Thr495 或Tyr657 的不利磷酸化［16］。導致eNOS 活性喪失，甚至解偶聯［6］，后兩者會加速衰老。此外，O2-和ONOO-是介導氧化應激、降低的NO 可用性和抑制eNOS 活性的主要自由基，它們會對蛋白質、脂質和DNA 造成氧化損傷。O2-通過增加eNOS解偶聯、降低eNOS 蛋白表達、上調eNOS 抑制劑ADMA的形成以及降低輔因子四氫生物蝶呤的生物利用度，造成NO合成減少；ONOO-可誘導eNOS蛋白的構象破壞最終加劇O2-產生。在大鼠心肌梗死模型中，抑制ONOO-可減少心肌損傷。紫檀芪通過抑制氧化或硝態應激來減輕MIRI。糖尿病通過抑制eNOS 磷酸化表達、降低NO 可用性和增加血管收縮因子內皮素-1 用量誘導氧化應激，導致內皮功能障礙［17］。細胞水平的氧化應激在心肌梗死后的心肌重構中也起關鍵作用。動物實驗表明，在過度表達eNOS的轉基因小鼠中，心肌梗死后的心肌重構減弱、血管生成增加、心肌纖維化減少。細胞實驗表明，受到過氧亞硝酸鹽或次氯酸的攻擊時，可使eNOS解偶聯［18］。其次，NO生物利用度降低也是氧化應激造成的結果。硝酸異山梨酯通過清除過氧亞硝酸鹽替代NO防止有機硝酸鹽誘導的氧化應激［12］；NO的過量生成和過氧亞硝酸鹽的生成可導致基質金屬蛋白酶-2的激活，降解肌鈣蛋白，改善MIRI［19］。綜上，氧化應激會開啟eNOS氧化還原開關并加重MIRI。

3.3 炎性反應 MIRI 可導致廣泛的炎性反應，使細胞因子如腫瘤壞死因子-α 及白細胞介素1、2、6、8和18，黏附分子如血管細胞黏附因子1、細胞間黏附分子1和E-選擇素表達增強，介導白細胞滾動、黏附和跨內皮遷移，并引發炎癥級聯反應［14］。降低eNOS啟動子活性后可表現為促炎和促凝狀態，eNOS表達和活性降低是對炎癥、免疫或代謝損傷的反應，也是內皮功能障礙的特征性表現［20］。一種多功能細胞黏附分子已被證明可維持eNOS 活性和NO 生物利用度，并調節炎癥過程中白細胞的外滲［10］。此外，氧化應激和缺氧也可以誘導炎性反應。維生素D通過抑制促炎細胞因子的產生，上調eNOS 活性來抑制炎性反應［13］。動物實驗表明，補充四氫生物喋呤可使eNOS 活性增加，降低缺血后心肌中性粒細胞的激活，改善心肌血流灌注。肼丙嗪通過減少炎癥因子釋放，減輕MIRI 和細胞凋亡［21］。糖尿病可增加MIRI 中白細胞浸潤，促使左心室功能不全和梗死面積擴大［17］。其次，eNOS產生的NO，可維持內皮與周圍組織之間的穩態，并作為一種有效的抗炎劑，抑制白細胞與血管壁的相互作用，從而減少病理性炎癥和血栓形成。在eNOS 基因敲除MIRI 小鼠模型中，白細胞與血管壁的黏附率提高了10 倍，增加NO 后可抑制炎癥反應［6］。綜上，增加eNOS 活性可抑制炎性反應，減輕MIRI和心肌細胞凋亡。

4 eNOS介導的信號通路與MIRI的關系

4.1 磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/eNOS 信號通路 PI3K/Akt/eNOS 信號通路是激活eNOS、調節NO水平的主要信號通路。eNOS 主要表達于哺乳動物心肌細胞，是Akt 的下游因子，Akt 使eNOS Ser1177 磷酸化，誘導NO 產生［22］。氫嗎啡后處理通過激活該通路，增加Akt 和eNOS 的磷酸化，上調總NO 和硝基酪氨酸的水平，發揮治療MIRI 的作用。高膽固醇血癥可以下調eNOS 的表達，減少NO 的產生，并誘導血管內皮功能障礙，影響冠脈功能［23］?，F有證據表明，PI3K/Akt/eNOS 信號通路通過各種干預措施（如延遲預處理、右美托咪定和黃芩苷的應用）在心臟保護機制中起重要作用。在氧化應激方面，MIRI 期間外周阻力血管中過量的活性氧和活性氮可使PI3K /Akt/eNOS 通路變鈍，引發內皮功能障礙。缺血預處理通過消除活性氧來減弱由過氧亞硝酸鹽介導的蛋白質酪氨酸硝化作用，并激活該通路保護內皮。eNOS基因敲除后可以顯著增加心肌對MIRI的敏感性，并消除缺血預處理的保護效應。異黃酮通過激活該通路改善MIRI并減弱的氧化應激。在細胞凋亡方面，肼丙嗪預處理不僅能阻斷MIRI 誘導的PI3K、Akt 和eNOS 的磷酸化，還通過該通路抑制心肌細胞凋亡［21］。在炎性方面，激活該同路可增加Akt、eNOS 的磷酸化和NO的生物利用度，減少下游炎癥反應，發揮抗炎作用［24］。遂該通路在MIRI 中可發揮抗炎、抗凋亡、抗氧化應激作用。

4.2 SIRT1/eNOS 信號通路 SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰酶，參與氧化應激及細胞凋亡、分化和衰老的調節。與正常心臟相比，MIRI 時心肌組織SIRT1 表達降低，SIRT1 過表達時可減輕MIRI，所以SIRT1使心臟對MIRI更具抵抗力。SIRT1 是一種強大的調節劑，用于維持eNOS功能和活性形式。SIRT1 與eNOS 具有協同作用，抑制SIRT1 活性可使eNOS 乙酰化并抑制eNOS 活性。SIRT1 可增強糖尿病患者心臟中eNOS 磷酸化，減輕MIRI 和氧化應激［25］。SIRT1 并不是eNOS 的直接上游，SIRT1 通過脫乙?；嚢彼?96、506 來激活eNOS，使NO 水平升高，增強eNOS 抗氧化應激能力［26］。在大鼠心肌梗死模型中，咖啡酸鄰硝基苯乙酯通過SIRT1/eNOS/核因子-κB 途徑減少腫瘤壞死因子-α 釋放和膠原沉積，激發SIRT1 和eNOS 的表達，增強NO 釋放并抑制核因子-κB 信號傳導，從而降低丙二醛水平和細胞壞死，發揮抑制氧化應激、炎癥反應、纖維化和壞死細胞增多癥來改善MIRI，并在缺氧復氧心肌細胞模型中抑制細胞凋亡和活性氧產生來減輕MIRI［27］。姜黃素通過激活SIRT1 信號通路減輕MIRI誘導的線粒體氧化損傷。同樣，白藜蘆醇通過激活SIRT1 而減少MIRI，而煙酰胺（SIRT1抑制劑）以劑量依賴的方式加重心肌細胞凋亡，表明SIRT1 可以減輕心肌細胞凋亡。SIRT1 刺激核因子-κB、eNOS 脫乙?；?，導致核因子-κB 轉錄受抑制，使eNOS 活性被促進［27］。此外，SIRT1/eNOS 軸是血管衰老的潛在靶標，血管老化伴隨著eNOS 表達或活性降低。與成年人相比，老年人的eNOS 蛋白水平降低，但老年人和兒童之間的eNOS 水平沒有顯著差異。人源性激肽釋放酶結合蛋白通過該信號通路逆轉過氧化氫產生，解除對eNOS 和SIRT1 的抑制，發揮抗衰老和抗氧化作用［28］。遂該通路有抗炎、抗凋亡、抗衰老及抗氧化應激作用。

4.3 腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMPK）/eNOS/NO信號通路 AMPK 是一種被視為記錄細胞能量水平“電量計”的關鍵激酶，廣泛表達于大腦、心臟、卵巢和子宮以及其他組織中，也是啟動自噬的關鍵分子。eNOS Ser1177 是AMPK 的底物。激活AMPK/eNOS信號通路可加速生成新生血管，特別是在缺血應激條件下。AMPK 活化后使內皮細胞內eNOS 直接磷酸化并發揮保護內皮功能作用。AMPK/eNOS通路也參與缺血性心肌的血管保護。AMPK 通過誘導心肌細胞自噬、減弱內皮細胞應激以及通過eNOS介導的NO 產生來減少心肌耗氧量，從而促進缺血性心肌存活［29］。在MIRI過程中，長期過量或過少的NO代謝產物均對心肌細胞產生不利影響。NO是否作為斑塊進展的保護劑，取決于其濃度、伴隨的介質和斑塊發展的階段。NO 通過抑制低密度脂蛋白氧化，高密度脂蛋白通過載脂蛋白A 介導對清道夫受體B 型功能的作用，增加NO 的產生［30］。NO 的生物利用度可被eNOS 表達或活性的減少影響，如eNOS解偶聯產生O2-，以及通過與O2-反應降解NO，導致ONOO-形成，降低NO 的生物利用率［29］。在心肌細胞缺氧復氧模型中，缺血后處理通過AMPK/eNOS信號通路增加eNOS 和AMPK 的磷酸化來減輕MIRI。在小鼠心肌梗死模型中，缺血后處理可減少心肌梗死面積并改善心室重構。所以該通路通過保護內皮、穩定斑塊、調脂和抗氧化應激來減輕MIRI。盡管增加eNOS 有益磷酸化和減少解偶聯，有減少內皮功能障礙、抗氧化應激和抗炎作用，并通過PI3K/Akt/eNOS、SIRT1/eNOS、AMPK/eNOS/NO 等信號通路減輕MIRI，但目前仍需多種治療方法聯合作用治療MIRI，還需深入探究MIRI 的發生機制及涉及通路、調控靶點指導臨床治療。研究eNOS 及其介導的信號通路在MIRI的發生、發展及預后中的作用，對防治MIRI具有重要意義。