心肌細胞中早期內涵體的作用研究進展

祖麗皮亞·阿不力海提，曾江正

1 海南醫學院第一臨床學院，海口 570102；2 海南醫學院第一附屬醫院腫瘤內科

內涵體是膜運輸過程中的重要細胞器，根據其形態結構和功能分為三種類型，即早期內涵體（EE）、晚期內涵體（LE）和分選內涵體（SE）［1-2］。EE是接受從細胞質膜內吞轉入物質的第一個內吞區室，而且是一個高度活躍的結構，具有很高的同型融合傾向［3］。EE 的主要作用是根據內吞物質的去向而對內吞物質進行分類，決定這些物質重新回到質膜中還是進入溶酶體中被進一步降解或傳遞至反式高爾基網絡中［4］。SE是內吞物質進行細胞內循環的膜室結構，通過“快速”回收途徑和“慢速”回收途徑將內吞物質再次回收到細胞質膜中。在“快速”回收途徑中，SE 將內吞物質直接從EE 上回收至細胞質膜中，然而在“慢速”回收途徑中，膜小管先將物質運送到核周的內吞循環室（ERC）［5］。ERC 后續會產生流向細胞質膜的循環內涵體，從而將物質回收至細胞質膜中。這兩種途徑都是SE 維持細胞內物質循環的作用機制。如果內涵體的形態結構或功能發生異常，都能夠影響細胞正常功能，導致機體出現相關疾病。心肌細胞的代謝非常旺盛，其功能由各種受體和體液調節。因此心肌細胞中的內涵體，尤其是EE 的功能非常重要。本文對EE 在心肌細胞中的作用，尤其是近年來的研究進展進行概述。

1 EE的結構和成熟過程

1.1 結構 EE是由于細胞內吞作用形成含有內吞物質膜結合的細胞器，在大多數細胞中，EE表現為一個精細且復雜的多形性區室結構，由薄管狀延伸物（直徑約為60 nm）和大囊泡（直徑約為400 nm）組成，具有膜內陷且能形成多囊狀外觀的特點［6］。EE表面具有特定的蛋白質和脂質成分，二者作為EE表面標志物，在細胞內吞過程中發揮重要作用。

EE中的重要蛋白質包括以下幾種。①Ras相關結合蛋白（Rab）：也稱為小GTP結合蛋白，其中Rab5是EE最具代表性的表面標志物，它參與物質從質膜到EE 的運輸過程［1，6］。②人VPS34/p150 磷脂酰肌醇3 激酶復合物：是Rab5 效應蛋白之一，其最主要的作用是產生磷脂酰肌醇［PtdIns（3）P］，PtdIns（3）P為EE 中最豐富的磷酸肌醇［1-2］。③EE 抗 原-1（EEA1）：是Rab5 效應蛋白，主要作用是調節EE 融合過程［1，5］。④可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子受體附著蛋白受體：它是一類高度保守的膜蛋白，可調節膜運輸中的融合過程。⑤C-末端Eps15 同源結構域蛋白（EHD）：哺乳動物細胞中的EHD 主要包括EHD1～4 四種類型，既可調節受體的回收過程，又可在EE 運輸中與Rab5、Rab4 協同發揮作用。⑥EE 中的動力蛋白：如動力蛋白-動力蛋白激活蛋白復合物，它是參與EE 囊泡運動的運動蛋白復合物之一［1-2］。

除此之外，EE 中的脂質PtdIns（3）P 通過招募含有特定結構域的蛋白質，在膜轉運途徑中發揮關鍵作用［1］。

1.2 成熟過程 EE 在形態、定位、組成、功能等方面具有明顯的異質性，而且具備很強的同型和異型融合的能力［2］。內涵體膜上的GTP 酶從Rab5 到Rab7的轉換標志著EE逐漸成熟為LE。值得注意的是，Rab7 是典型的LE 標志物。內涵體中Rab5 的丟失與Rab7 的獲取同時發生的這一過程被稱為“Rab轉換”。研究表明，Rab 轉換是細胞外環境中的物質從EE傳遞至LE的機制。內涵體中所有的分子活動都具有嚴密且精準的調控機制，EE的成熟過程也不例外。EE 向LE 的轉變是在復雜的正反饋環路調控下進行的。首先，Rab5 被Rabex5 募集到內涵體上，Rabex5 是Rab5 特異性的鳥嘌呤交換因子。隨后，Rab5效應因子Rabaptin-5進一步促進鳥嘌呤交換因子的活動，整個過程為Rab5的激活提供了一個正反饋環路［4］。SAND-1/Mon1 是EE 成熟為LE 過程（也稱為Rab 轉換）的轉換開關，可以調控Rab5 和Rab7的活性狀態。在這一過程中，SAND-1/Mon1 通過取代EE 膜上的Rabex5 而作為正反饋環路的干擾物，而且，它也通過與Rab7 的鳥嘌呤交換因子HOPS 復合物相互作用來積極推動Rab7 在內涵體上的募集過程。除此之外，內涵體成熟的另外一種機制是磷酸肌醇轉換（PI conversion），這里的PI指PtdIns（3）P、PtdIns（3，5）P（2），它們是鑒別EE 和LE 膜的兩種不可或缺的脂質［2］。二者可以招募許多具有PI結合域的效應蛋白，包括FYVE、PH、PX、GRAM，從而實現PI轉換。換句話說，PI轉換本質上是通過PIKfyve的募集來實現PtdIns-3-P到PtdIns-3，5-P的轉換。除了內涵體形態結構的變化，作為內吞細胞器，內涵體腔內環境pH 的改變也是內涵體成熟的必然條件。EE的pH 6.1～6.8，LE的pH 4.8～6.0，而溶酶體的pH則可降至大約4.5［4，7］。由此可見，內涵體的成熟必須經過酸化這一重要的腔內變化。酸化是由液泡型H+ATP酶調控，它們是大型復雜的質子泵，由膜相關的V0 復合體（可充當質子的跨膜孔）和可溶性的胞質V1復合體（可結合并水解ATP）構成。管腔pH 值的調節包括V-ATPase濃度的調節、V-ATPase亞型的選擇以及V0 和V1 復合物的結合、解離等［7］。在此過程中，越來越多的H+進入EE 管腔，引起pH 下降，導致EE向LE形態變化的發生。

2 EE的作用及相關疾病

2.1 作用

2.1.1 分選作用 如上所述，EE 是通過內吞途徑對物質（如受體和脂質等）進行分類的關鍵站點，這正是EE 首要且最有價值的功能［1］。物質被EE 吸收后分類到各種內吞途徑中，包括被回收到細胞質膜中、在溶酶體中降解或運送至反式高爾基體網絡（trans-Golgi 網）中［8］。EE 參與膜轉運介導的營養吸收、免疫、細胞遷移、黏附和細胞分裂等基本過程。因此，EE的分選作用對哺乳動物細胞維持正常功能至關重要［5］。

2.1.2 在細胞中的多種作用 EE 是信號通路中的調控連接器［9］，EE 的運動在細胞中具有多種作用。EE 可以將致病因子從感染的菌絲頂端轉移到細胞核。而且，EE的運動在信號正確解碼過程中的作用不可忽視［10］。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）激活的ERK/MAPK 信號通路也是由EE 分選調控。NMDAR信號通路異常與幾種癌癥相關，如阻斷NMDAR 受體可對乳腺癌細胞株中EE 的功能產生顯著作用，這表明異常的谷氨酸信號通路可能通過內吞動力學的失調促進了癌的發生［9］。因此，糾正NMDAR 依賴性膜轉運過程中的缺陷可能為癌癥治療提供潛在的研究方向。

2.1.3 在細胞自噬中的作用 自噬是在正常和應激條件下維持細胞內穩態的細胞內降解途徑。EE參與自噬囊泡或降解性自噬囊泡的形成［11］。內涵體中的一些蛋白質，如Rab 蛋白（Rab11、Rab33b、Rab5、Rab7）及EEA1都可影響自噬過程［12］。細胞內吞和自噬之間存在著相互作用［13］。因此，Rab 蛋白既可調節細胞內吞又參與自噬過程，從而能夠控制細胞內環境的穩態。因此，EE是內吞和自噬通路調節細胞穩態所必需的。

2.2 相關疾病 蛋白質、脂質等大分子物質與EE聯系途徑中的缺陷干擾了EE 的成熟過程和功能。EE 成熟過程中Rab5-Rab7“轉換開關”的破壞可能是導致EE 腫大的機制之一，而EE 的異常腫大或數量增多是多種疾病的發病機制［2］。研究表明，在阿爾茨海默病的早期階段，許多神經元的Aβ 肽水平升高，并且Rab5 陽性的EE 增大［14］。類似的內吞缺陷也見于唐氏綜合征、尼曼-皮克病C型和老年性黃斑變性。Rab5 內涵體運動能力的降低導致亨廷頓病患者的神經退行性變。EEA1 的表達恢復了MECP2 缺失神經元的穩態突觸可塑性，為干預Rett綜合征提供了新的靶點［15］。而且，研究發現，在帕金森病和HIV-1 Tat神經毒性中均存在內涵體-溶酶體系統功能障礙［14］。

3 EE在心肌細胞中的作用

3.1 EE 在心臟電生理中的作用 正常的心臟功能依賴于膜離子通道、轉運體、泵、激素受體的協同活動來動態調節膜電化學梯度以應對急性和慢性應激［16］。在膜蛋白的表達和定位過程中，內涵體系統是主要的調節因子，同時它也調節心臟的興奮性。EHD3 是EE 的標志物之一，是心臟內蛋白質轉運的重要組成部分，通過調節心室內Na+/Ca2+交換器（NCX）和電壓門控L型Ca2+通道的順行轉運，維持心臟興奮性［16］。EHD3 在心臟膜蛋白運輸和正常生理中起關鍵作用，并與心臟疾病的發生密切相關。EHD3 缺乏的小鼠表現出心動過緩、心率下降、Ⅱ型傳導阻滯和對β2-腎上腺素受體刺激的遲鈍反應，在保持心輸出量不變的情況下，EHD3 缺乏小鼠的心臟顯著增大。此外，EHD3 與細胞骨架膜適配蛋白（AnkB）之間存在直接的蛋白/蛋白相互作用。AnkB 和EHD3 功能喪失可導致心臟功能嚴重受損，最終導致患者出現心室顫動、心房顫動、竇房結疾病、房室傳導阻滯、心源性猝死等［17］。EE 的其他標志物也參與離子通道的轉運。如Rab5 是快速內吞電壓門控K+通道（Kv通道）的主要效應體，這對心肌細胞的動作電位復極至關重要。Rab4 參與Kv1.5通道的內化后轉運［18］。此外，在心臟興奮收縮耦聯過程中，心室肌的動作電位觸發單個肌細胞中電壓依 賴 性 的L 型Ca2+（CaV1.2）通 道 短 暫 打 開［23］。CaV1.2 通道的三種內涵體宿主分別位于Rab4 陽性的EE、Rab11 陽性的循環內涵體和Rab7 陽性的LE/溶酶體［19］。CaV1.2 通道在心肌細胞肌膜上的表達受EE 及其蛋白標志物特別是Rab 蛋白的嚴格控制和調控，并不斷被EE 內化、分類、循環。而且，在應對急性缺氧和缺血時，心臟NaV1.5 通道中有促心律失常的晚期鈉電流通過，被稱為缺氧誘導晚期電流。心肌缺氧可引起Na+內流增加、細胞內Na+濃度升高以及膜電位去極化，這是導致致命性心律失常的常見機制［20］。因此認為EE 是調節離子通道交換的關鍵細胞器。探索EE 在離子通道轉運中的作用及其調控機制對維持正常心臟功能、深入了解心臟疾病的發病機制具有重要意義。

3.2 EE 在心臟疾病診斷中的作用 EE 起源于外泌體，而外泌體在急性心肌梗死（AMI）中具有很強的信息傳遞潛能［21］，并且已被用作診斷癌癥的生物標志物。EE 通過內涵體膜向內出芽形成腔內囊泡（ILV），也稱為外泌體前體。ILV 與質膜融合，釋放ILV 到細胞外空間（外泌體）［22］，這一過程以依賴于運輸所需的內涵體分選復合體（ESCRT）或不依賴于ESCRT 的方式進行。外泌體也可將具有生物活性的RNA 分子轉移到靶細胞。在AMI中，與心肌肌鈣蛋白相比，可以更早在血液中檢測到心肌特異性miRNA（心肌梗死后＜4 h），外泌體可為診斷或預測缺氧缺血性疾病的潛在生物標志物［23］。由于來自EE 的外泌體在心臟疾病中有重要作用，因此EE 可能成為心臟疾病診斷的標志物之一。但目前該結論仍不完全明確，有待進一步探索。

3.3 EE在心臟相關受體的內化、表達、調節和細胞致敏中的作用 EE還參與許多受體的內吞過程，這些受體在心血管系統中發揮重要作用。蛋白酶活化受體（PAR）是G 蛋白偶聯受體［24］，能引起細胞對凝血和抗凝血蛋白酶的反應。與β2-腎上腺素受體一樣，激活后的PAR 迅速磷酸化并與信號通路解耦，然后立即內化到EE 中，并被分選到溶酶體進行降解。而未激活的PAR 在細胞表面和EE 之間不斷循環，并產生內部受體池，這對補充細胞表面未激活的受體起重要作用，從而促進細胞的再敏化。除此之外，心肌對凝血酶有特異性反應，這說明心肌細胞中存在一種新的凝血酶受體，這種受體可能在心律失常發生中發揮作用，或具有繼發于復極延長的抗心律失常作用，其與PAR 以同樣的方式內化到EE 中。EE 在血管內皮生長因子（VEGF）的內吞和膜轉運中具有相似的分選功能，VEGF 是血管生成的關鍵因素，在冠狀動脈旁路形成中發揮核心作用［25］。

3.4 EE 在心力衰竭中的作用 心肌是一種高度氧化性組織。線粒體融合、裂變、起源和線粒體吞噬不僅與心血管疾病有關，而且對于維持最佳心臟功能至關重要。線粒體功能受損、線粒體吞噬減少及衰老過程與心力衰竭的發生和進展有關［26］。如前文所述，在哺乳動物細胞中，EE 在內涵體和自噬通路中都是必需的，它還可以通過包括選擇性自噬、微自噬和內涵體-溶酶體降解等途徑清除受損的線粒體［27］。Rab5 依賴的內涵體途徑可以清除E3 泛素連接酶Parkin 標記降解的去極化線粒體。此外，Rab5陽性的EE 通過ESCRT 機制將線粒體內化，然后將其傳遞到溶酶體降解［28］。EE 在線粒體清除中發揮重要作用，有望成為治療或預防心臟疾病的靶點。

3.5 EE 在病毒侵入心肌細胞中的作用 很多病毒依靠低pH激活融合蛋白，融合蛋白能夠將病毒包膜與內涵體膜結合［29］。EE 表面的脂質和蛋白質與病毒融合的完成與將病毒核衣殼釋放到細胞質有關［30-31］。EE 酸化不足延遲了禽肉瘤與白血病病毒融合［32］。病毒融合需要酸性的EE 環境，而EE 的成熟必須經過酸化才得以實現，這意味著抑制早期向LE 轉化的過程可能會干擾病毒的融合，從而抑制病毒侵入細胞。病毒性心肌炎的發生可能與病毒和宿主細胞膜融合過程緊密相關。如果干擾EE 成熟的過程，可切斷病毒侵犯心肌細胞的途徑，從而進一步控制病毒性心肌炎的進展。因此，EE有望成為病毒性心肌炎干預治療的新靶點。

EE能從細胞外環境中接收大分子物質和溶質，通過分選機制決定內吞物質的去向。EE 表面標志物具有特定的蛋白質和脂質成分都在細胞內吞過程中發揮重要的作用。EE因其結構和功能的多樣性，在維持心肌細胞正常功能，心臟疾病發生、發展及治療中具有重要意義，通過對EE的研究也為從分子生物學角度了解心臟疾病的發生機制奠定基礎，同時為心臟疾病的藥物靶向治療、分子干預治療等提供理論依據。