轉化生長因子β1在宮腔粘連中的研究進展

李光璨，翟超，張曉軒，任春娥

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）亦稱Asherman綜合征[1]，是指由于子宮內膜基底層受損，宮腔內形成局部纖維化組織，進而引起子宮內膜表面相互粘連、宮腔部分或完全閉塞。目前認為，有創宮腔操作是導致IUA的最主要因素，此外，宮腔感染、生殖器結核等病理狀態也會對子宮內膜組織的功能產生影響[2]。IUA是一種纖維化疾病，實質是大量的子宮內膜被纖維性組織取代[3]，且大多數情況下還可能伴隨過度炎癥反應及血管閉塞萎縮，使子宮內膜失去原有的血液供應，生長緩慢，甚至喪失正常的生理功能。IUA的臨床表現主要有月經改變、不孕及妊娠丟失、反復胚胎種植失敗等，嚴重影響育齡期女性的生殖健康。目前IUA的治療方式主要為宮腔鏡下宮腔粘連分離術（transcervical resection of adhesion，TCRA），宮腔鏡下冷刀分離術是近年來的新興術式，相較于傳統的宮腔鏡下電切術而言，其手術創傷小且無電熱輻射，可有效避免子宮內膜的繼發性損傷，減輕組織炎性反應，且在術后輔以預防粘連復發的措施，如宮腔內放置透明質酸鈉、口服雌孕激素等，更有助于IUA的控制與恢復。盡管采用了諸多預防術后再粘連的方法，但術后的IUA復發率仍較高，重度IUA的復發率甚至高達20%～62.5%[4]。因此，闡明IUA形成的分子機制，對防止IUA術后復發、提高妊娠率及活產率具有重要意義。但IUA的發病機制目前尚未明確，纖維細胞增生活躍學說認為其本質是子宮內膜纖維化，因此，研究纖維化相關因子及其信號通路與IUA之間的關系尤為重要。轉化生長因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）是目前已知最重要的促纖維形成細胞因子，已成為細胞纖維化的重要標志，學者們認為TGF-β1與IUA的發生關系密切。現就TGF-β1及其相關通路在IUA纖維化方面的研究進展進行綜述。

1 TGF-β超家族概述

TGF-β超家族是一組具有多效性和復雜性的細胞因子，有活性的TGF-β超家族分子皆為2個亞基通過二硫鍵結合形成的同源或異源二聚體。目前根據其在機體發育中發揮的作用將TGF-β超家族成員分為TGF-β亞型（TGF-β1/2/3）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）、激活素（activin）、抑制素（inhibin）和抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）等[5]。它們在調節細胞增殖分化、內環境穩定、免疫反應及細胞外基質產生等方面發揮重要作用，各成員間既存在協同作用又有拮抗作用，構成一個復雜而又精細的調控網絡，倘若超出其代償范圍出現炎癥、纖維化和腫瘤等情況時，常可檢測到家族某些分子的異常表達。

2 TGF-β信號通路

2.1 TGF-β/Smad信號通路TGF-β具有3種亞型（TGF-β1/2/3），它們雖然由3種不同的基因編碼，但是通過相同的信號系統發揮作用。TGF-β1主要在內皮、造血和結締組織細胞中表達，TGF-β2在上皮細胞和神經元細胞中表達，而TGF-β3主要在間充質細胞中表達。TGF-β具有3種受體，其中Ⅰ型和Ⅱ型受體是由絲氨酸和蘇氨酸激酶組成的跨膜受體復合物，Ⅲ型受體主要負責增加前兩者的結合親和力。Smad蛋白位于TGF-β/Smad信號通路下游，在該通路信號轉導及轉錄調控中發揮重要作用，大致可分為3類：調節型Smad（R-Smad）、共同通路型Smad（Co-Smad）和抑制型Smad（I-Smad）[6]。在TGF-β經典信號通路中，TGF-β配體通過結合細胞膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型受體觸發信號傳導[7]。首先與Ⅱ型受體結合成為活化型，由于Ⅱ型受體具有持續的磷酸激酶活性，因此Ⅰ型受體與之結合后可被激活，形成的受體復合物可與R-Smad發生短效磷酸化，隨后RSmad與受體復合物分離與Co-Smad相互作用，并以復合物的形式進入細胞核，并在細胞核內對TGF-β超家族Smad依賴性信號途徑發揮調節或抑制作用。抑制型調節因子可以阻斷R-Smad與Ⅰ型受體結合的作用，或增強受體的降解作用，從而阻斷TGF-β1的信號傳導[8]。

2.2 TGF-β1/Smad信號通路與組織纖維化眾所周知，TGF-β1在組織器官纖維化的發展過程中具有重要作用，有眾多實驗表明TGF-β1在纖維化器官中的表達顯著上調，是一種高效的促纖維化調節因子。其具有多種生物功能，如調節細胞生長、分化和凋亡，促進細胞外基質的分泌及沉積，并可誘導上皮-間質轉化，增強并維持促纖維細胞的活力。有研究表明TGF-β1/Smad通路參與了組織纖維化的過程[9]。該通路與人的心臟、肺、肝臟和腎等多種器官的纖維化有關。TGF-β1是肝臟中最重要的致纖維化細胞因子，TGF-β1/Smad信號通路的激活會抑制肝實質細胞的再生[10]，在加重纖維化的同時還會產生大量結締組織生長因子，加重細胞外基質沉積，導致肝纖維化。另有研究表明，在肺纖維化過程中TGF-β1/Smad信號通路被激活，促使成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，肺泡上皮細胞和內皮細胞向間充質細胞轉化[11]，減少或抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）的分泌，導致大量細胞外基質無法正常降解，使其在肺部積聚引起肺纖維化。

2.3 TGF-β1/Smad信號通路與炎癥反應 機體在遭受創傷或持續處于感染狀態時，會刺激炎癥細胞形成并釋放大量炎癥因子。如在腎臟中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的高表達會導致組織纖維化，加劇腎臟惡化的同時會刺激機體發生更劇烈的炎癥反應，白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）通過激活中性粒細胞釋放炎癥介質，而TGFβ1可以通過激活TGF-β1/Smad信號通路進一步促進兩者的表達[12]。Qiao等[13]的研究表明，TGF-β1的低表達可以抑制炎癥反應并阻止纖維化進展。通過研究人類子宮內膜標本和動物模型發現，在IUA形成過程中，TGF-β1/Smad信號通路的激活不僅可以啟動下游一系列信號通路促進纖維化，同時還刺激多種與炎癥相關的因子，如MMP-9、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、血 管 內 皮 生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，它們均能夠通過TGF-β1/Smad信號通路參與炎癥及促纖維化反應。其機制主要為感染、創傷使子宮內膜基底層受損，激發炎癥反應的同時還可能伴隨子宮內膜血管及雌激素受體部分或完全缺失，使子宮內膜周期性修復功能受到影響，并啟動自發性纖維性修復，引起IUA的發生。

3 TGF-β1與IUA

3.1 TGF-β1/Smad通路在IUA中的表達Xue等[14]研究證實IUA患者子宮內膜組織中TGF-β1的表達顯著高于非IUA患者，提示TGF-β1通路參與了子宮內膜纖維化過程，在IUA發病機制中發揮著重要作用。其機制主要為TGF-β1/Smad信號傳導引起成纖維細胞增殖和組織纖維化[15]。且在成纖維細胞TGFβ1信號傳導過程中，Smad3比Smad2的作用更為關鍵和重要[16]。有研究發現，在重度粘連子宮內膜組織中，TGF-β1、Smad3/4的表達顯著上調，而Smad7表達明顯下調，且TGF-β1與Smad3/4表達水平呈正相關，與Smad7表達水平則呈負相關，這說明在TGFβ1/Smad信號通路中，Smad3過度正調控和Smad7負調控不足均可能并影響IUA的發生、發展[17]。

3.2 TGF-β1在IUA中的調控機制TGF-β家族主要通過Smad信號通路影響細胞生命活動，也可激活其他信號通路交叉發揮作用，或作為對Smad途徑的補充途徑對細胞活動進行調節。

3.2.1 TGF-β1與Wnt Wnt相關信號通路對于促進細胞增殖、維持組織穩態起到關鍵作用，在一定條件下可以調節干細胞的更新及分化[18-19]。在子宮內膜中，該信號通路可以有效促進子宮內膜組織的生長及修復。Garcia-Alonso等[20]研究發現Wnt信號在增殖期子宮內膜中呈現明顯的增強趨勢，而該信號通路活性在分泌期則受到明顯抑制，這可能與Wnt與雌、孕激素之間產生復雜的交互作用有關，提示Wnt信號通路深度參與調節子宮內膜的周期性變化。目前研究認為，Wnt信號通路與纖維化疾病密切相關，而TGF-β1是激活經典Wnt信號通路的主要刺激物，促使其激活成纖維細胞、促進細胞外基質成分的釋放，兩者聯合在組織纖維化過程中發揮重要作用[21]。有研究探討TGF-β1及Wnt/β聯蛋白（β-catenin）信號通路對子宮內膜基質細胞的影響，結果顯示，TGFβ1有效誘導了Wnt信號通路相關分子的表達、促進了子宮內膜基質細胞纖維化，同時Wnt信號通路配體（Wnt3a）聯合TGF-β1誘導組的促纖維化作用較單一誘導組效果更為顯著[22]。Liu等[23]研究發現，通過干擾TGF-β1作用于Wnt信號通路的靶點可以顯著抑制TGF-β1對子宮內膜細胞的纖維化作用。最近的一項研究結果亦證實，通過靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路可以抑制TGF-β1誘導的上皮-間質轉化過程，下調Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及纖維連接蛋白等細胞外基質成分的表達，而應用Wnt/β-catenin通路激動劑則逆轉了這一現象[24]。TGF-β1與Wnt信號通路之間的關聯串擾是促進子宮內膜纖維化及發生IUA的重要機制，然而Wnt信號通路在促進子宮內膜纖維化形成、參與IUA病理過程的同時，還參與了子宮內膜的修復過程，該通路與雌激素協同具有促進子宮內膜增殖的作用，并可誘導子宮內膜干細胞的分化，有望用于治療IUA。

3.2.2 TGF-β1與NF-κB NF-κB是一種重要的轉錄因子，其相關通路在介導機體炎癥反應、細胞分化、氧化應激等生物過程中發揮重要作用。靜息狀態下，NF-κB主要存在于細胞質中，并與NF-κB抑制蛋白穩定結合。當機體處于應激狀態時，NF-κB發生磷酸化，激活后被釋放轉移至細胞核內，啟動下游炎性因子（如TNF-α、IL-1）的轉錄合成，而上述炎性因子又以正反饋的方式持續刺激NF-κB發揮作用，加速促炎癥反應發生[25]。早期研究證實，在腎纖維化組織中存在TGF-β1介導的NF-κB通路的異常激活[26]。Conlon等[27]發現，應用淋巴毒素β受體抑制劑可有效抑制NF-κB的非經典激活，同時減弱TGF-β的信號傳導，改善氣道纖維化。這提示在不同器官纖維化疾病中NF-κB介導的炎癥反應與TGF-β介導的組織纖維化有關。既往研究發現，在IUA患者的子宮內膜組織中，TGF-β的表達及NF-κB信號通路的活性均顯著增強，且NF-κB通路活性與TGF-β的表達程度呈正相關，進一步的實驗通過阻斷NF-κB信號通路實現了對TGF-β表達的抑制[14]。Hua等[28]對IUA家兔模型進行研究，結果顯示應用人臍血間充質干細胞能有效抑制NF-κB亞基P65蛋白的表達，減弱受損子宮內膜的炎癥反應，下調TGF-β1表達，達到改善子宮內膜纖維化的目的。綜上所述，在子宮內膜微環境異常的情況下，TGF-β1和NF-κB通路可以通過相互作用加劇組織的炎癥反應，誘導纖維化產生，這提示未來或許可以通過靶向抑制NF-κB/TGF-β1通路誘發抗纖維化和抗炎效應，但目前兩者之間復雜的調控機制仍有待進一步探索。

3.2.3 TGF-β1與Hippo Hippo通路是一類進化上高度保守的信號通路，在調節組織生長發育、維持內環境穩態及平衡免疫狀態中發揮關鍵作用，學者們認為其與組織纖維化、腫瘤發展及傷口修復過程密切相關[29]。YAP和TAZ是Hippo通路主要的下游效應分子，在子宮內膜間質細胞蛻膜化過程中，激活的Hippo通路可以觸發YAP/TAZ的磷酸化過程，限制其進入細胞核發揮轉錄作用，從而抑制上皮-間質轉化。目前普遍認為，Hippo信號通路及其效應分子深度參與組織纖維化過程。Mooring等[30]研究發現，在肝細胞中增加Hippo通路的YAP活性可以增加肌成纖維細胞的活性，加速上皮-間質轉化，同時促進炎性因子（IL-1、TNF）的表達。之前的一項研究表明，YAP或TAZ能通過穩定修飾染色體結構促進心臟的成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，這一過程亦伴隨著細胞外基質成分表達的上調。而進一步的實驗結果顯示，干擾YAP介導的轉錄活動可顯著抑制TGF-β1誘導的肌成纖維細胞活性，從而降低組織的纖維化程度[31]。Smad作為與TAZ結合的蛋白之一，同樣受到激活的Hippo通路的影響。通常情況下，YAP/TAZ可以與TGF-β1通路下游的Smad2/3相結合，促使其在細胞核中發揮轉錄調控作用，而激活Hippo通路能夠顯著抑制YAP/TAZ的活動，繼而對TGF-β1通路所介導的纖維化過程產生負性調節作用[32]。Zhang等[33]研究發現，應用經血源性基質細胞可以顯著改善IUA大鼠的子宮內膜生長及血管生成情況，或許與通過激活Hippo通路減弱了子宮內膜纖維化及炎癥反應有關。已有大量研究證實了TGF-β1和Hippo通路在促纖維化過程中的相互作用關系，或許能夠為IUA的多靶點治療方式的開發提供新思路。

3.2.4 TGF-β1與MMP-9 MMP是自然界進化中高度保守的一類蛋白酶，屬于細胞外基質的降解酶之一，細胞外基質生成及降解之間的動態平衡是維持組織穩態、防止異常纖維化的重要一環，而MMP對細胞外基質的正常降解在其中起到至關重要的作用[34]。MMP-9主要參與胚胎發生、傷口愈合及纖維化等過程。已有研究表明，IUA患者子宮內膜中的激酶插入區受體（kinase insert domain containing receptor，KDR）水平與IUA的嚴重程度呈正相關，沉默KDR后TGF-β1/Smad通路受到極大抑制，在MMP-9表達明顯升高的同時子宮內膜的纖維化程度降低，提示在IUA的發生、發展過程中，TGF-β1與MMP-9之間的表達存在相關性[35]。一項前瞻性臨床試驗結果顯示，TCRA術后的IUA患者子宮內膜組織中TGF-β1表達高于對照組，MMP-9表達低于對照組，說明TGF-β1與MMP-9共同參與了IUA的形成與發展，且可以初步推測TGF-β1與MMP-9的表達水平呈負相關[36]。趙芳芳等[37]用過氧化氫（H2O2）處理人子宮內膜基質細胞，誘導建立氧化應激模型，發現相較于空白組，H2O2組細胞中TGF-β1表達水平顯著升高，而MMP-9表達顯著降低；反之，當抑制TGF-β1表達時，MMP-9的表達明顯增強。提示TGF-β1可能通過抑制MMP-9的表達降低纖維蛋白的溶解，促進了子宮內膜纖維化的發生并最終導致IUA。但有研究通過構建大鼠IUA模型觀察Smad3抑制劑（SIS3）對大鼠IUA相關因子表達的影響，結果卻顯示模型組MMP-9的表達水平高于對照組，但與IUA纖維化程度及TGF-β1的表達無明顯相關性[38]。這與前述的實驗結論不一致，可能是因為該實驗受到樣本數量及檢測方法的限制，也可能是因為MMP-9的表達并不絕對依賴于TGF-β1引導的纖維化過程，而是與子宮內膜受損后引起炎癥反應使大量炎癥細胞聚集產生MMP-9有關，具體機制有待深入研究。在IUA的發生過程中，TGF-β1與MMP-9的相關性需要更多的實驗數據來驗證，或許利用兩者之間的交叉對話可以獲得更為精準有效的治療方法。

3.2.5 TGF-β1與CTGF CTGF是CCN多肽家族的一種多功能蛋白，可誘導成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質，具有調節細胞增生分化、胚胎發育及傷口愈合等功能，能夠作為TGF-β、NF-κB等信號通路的下游效應因子參與調節炎癥、創面愈合及瘢痕形成等生物學過程。目前普遍認為，CTGF可以刺激Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的產生，誘導細胞外基質的合成，且其作為上皮-間質轉化調節的啟動子，可以與TGF-β1協同促進組織的纖維化進程[39]。有研究發現，TGF-β可以通過將促纖維化信號傳遞給Smad通路的方式來激活CTGF轉錄，而敲除CTGF因子后可顯著抑制TGF-β誘導的促纖維化反應[40]。李燦宇等[38]的研究表明，TGF-β1、CTGF可作為IUA的潛在分子標志物，兩者與IUA嚴重程度呈正相關，應用SIS3抑制TGF-β1/Smad信號通路可顯著減弱該通路對CTGF的誘導作用，進而減輕IUA。宗實等[41]的研究進一步證實了上述觀點，TGF-β1通過上調下游CTGF基因的表達，可調控結締組織增生，用VEGF基因修飾的間充質干細胞治療的大鼠子宮內膜小血管數量及腺體數量均優于未治療組，TGF-β1及CTGF的表達亦顯著降低，且伴有子宮內膜再生修復和IUA的顯著改善。因此，阻斷或抑制CTGF表達或許可以成為治療子宮內膜纖維化的潛在治療靶點，為子宮內膜的再生修復提供更有效的治療方式。

4 結語與展望

TGF-β1與諸多信號通路之間存在著復雜的調控關系，它們在IUA發生發展的多個重要環節中起關鍵作用。IUA在臨床上較為常見，但子宮內膜纖維化是一個復雜的病理過程，目前針對TGF-β1參與的發病機制仍需深入研究，明確上述復雜的調控過程，使未來應用抗TGF-β1抗體及相關通路抑制劑阻止子宮內膜纖維化進展成為可能。但目前的研究表明TGF-β1的表達機制復雜且作用廣泛，現有的靶向藥物難以對其實現精準調控，且容易對其他臟器產生較大的不良影響，尚無法廣泛應用于臨床，因此找出TGF-β1及其相關信號通路在子宮內膜纖維化過程中精確的作用靶點，將為今后開發更高效、更安全的特異性藥物提供新的研究策略，并為有效預防IUA的發生探索出更具特異性的治療方案。