Lactococcus lactis subsp.lactis HFY14對狼瘡性腎炎小鼠腎功能的改善作用

趙 欣，周雅琳，馮 霞

（重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067）

牦牛乳富含蛋白質和微量元素，營養價值優于普通牛乳，自然發酵牦牛酸乳具有特殊的風味和營養組成，還富含未經鑒定和開發的微生物資源[1-2]。從自然發酵牦牛酸乳中分離的乳酸菌發酵酸奶具有腸道調節、減脂和等保健功效[3-6]。另外，自然發酵牦牛乳中含有的微生物不僅種類豐富，還具有良好的抗性，是潛在的益生菌發掘資源[7]。

狼瘡性腎炎是一種因免疫失調引發的腎炎，嚴重的腎臟疾病出現后常常導致狼瘡性腎炎，進而引起腎小球炎癥[8]。狼瘡性腎炎發生后會引起機體一系列病變，除了腎小球炎癥外，還會出現淋巴結增生，嚴重時機體免疫失調，出現腎臟硬化、代謝及排毒失調，從而危及生命[9]。機體免疫系統中B細胞及T細胞被過度激活也是狼瘡性腎炎的主要表現，從而造成體內的T細胞出現分化，影響正常的免疫系統工作。有研究顯示益生菌干預下能夠保持T細胞在機體中的平衡，發揮益生菌干預腎炎的作用[10]。益生菌自身的肽聚糖和脂磷壁酸等成分能夠激活和加強免疫系統，提高機體免疫力；同時益生菌還能分泌出刺激免疫系統的活性物質，也能發揮提高免疫力的作用，機體免疫力提高后，炎癥引起的體內毒性物質被加速排出，促進了腎臟病變的恢復[11]。降植烷是一種能夠引起炎癥和使免疫失調的化學物質，在動物體內能夠使T細胞和B細胞的平衡被打破，造成動物機體免疫系統中出現異常抵抗，進而引發狼瘡性腎炎，因此常被用于構建實驗性狼瘡性腎炎模型，以檢測藥物或功能性食品的功效[12-13]。Lactococcus lactissubsp.lactisHFY14（LLSLHFY14）是從四川紅原高原藏族牧民自然發酵酸奶中分離出的一株菌，本研究通過降植烷誘導狼瘡性腎炎建立實驗動物模型，觀察Lactococcus lactissubsp.lactisHFY14的腎炎改善作用，并且通過進一步的分子生物學實驗分析Lactococcus lactissubsp.lactisHFY14發揮提高免疫力作用的機理。

1 材料與方法

1.1 菌株、動物、材料與試劑

Lactococcus lactissubsp.lactisHFY14分離于四川阿壩藏族羌族自治州紅原縣的自然發酵牦牛酸乳，該菌經過鑒定后在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了專利保藏，專利保藏號為CGMCC No.16647。

6 周齡的SPF級C57BL/J6小鼠，雌雄各半，共計50 只，體質量為（23±2）g，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。本研究中動物實驗經重慶市功能性食品協同創新中心動物實驗倫理委員會批準，批準號為2021050008B。

降植烷（純度≥98%） 美國Sigma公司；潑尼松（純度≥97%） 北京百靈威科技有限公司；白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12、干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、轉化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒以及血清肌酐（serum creatinine，SCr）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒 武漢賽培生物科技有限公司；TRIzol試劑、SYBR綠色聚合酶鏈反應反應混合物（SYBR Green PCR Master Mix）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、二喹林甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）上下游引物、一抗、二抗 美國Thermo Fisher Scientific公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BX43顯微鏡 日本奧林巴斯公司；UV-2600i紫外-可見分光光度計、StoponePlus qPCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；5500Multi化學發光凝膠成像系統上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

C57BL/J6小鼠在控溫（（20±1）℃）控濕（30%～40%）環境下實用性喂養1 周。實驗小鼠被隨機分為正常組、模型組、LLSLHFY14低濃度作用（LLSLHFY14-L）組、LLSLHFY14高濃度作用（LLSLHFY14-H）組和潑尼松組（藥物陽性組），每組10 只，雌雄各半。適應性喂養結束后對正常組小鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水溶液，同時對其余各組小鼠腹腔注射0.5 mL降植烷[14]。注射降植烷后第2天開始，LLSLHFY14-L組和LLSLHFY14-H組小鼠每日按108CFU/kgmb和109CFU/kgmb劑量灌胃LLSLHFY14活菌溶液，潑尼松組小鼠每日按10 mg/kgmb劑量灌胃潑尼松溶液，正常組和模型組小鼠每日灌胃0.2 mL蒸餾水，各組灌胃樣品12 周。12 周后采用毛細管眼眶取血對小鼠實施采血，然后斷頸處死小鼠，解剖小鼠取內臟，稱量胸腺和脾臟質量，根據式（1）、（2）分別計算胸腺指數和脾臟指數。

1.3.2 血清細胞因子質量濃度測定

將收集到的小鼠血液在4 ℃下1 500 r/min離心10 min，分離得到上層血清，然后根據ELISA試劑盒的方法對血清中IL-2、IL-12、IFN-γ、IgG和TGF-β細胞因子質量濃度進行測定[15]。

1.3.3 血清指標測定

通過1.3.2節方法分離出小鼠血清，按相應試劑盒方法對小鼠血清中的SCr、BUN、TC、TG、TP和ALB水平進行測定。

1.3.4 抗雙鏈脫氧核糖核酸抗體測定

注射降植烷后第2天開始每兩周（第2、4、6、8、10、12周）采用眼眶取血法對小鼠進行采血，然后以1.3.2節方法分離出小鼠血清后加入微孔板中，37 ℃下放置120 min，然后再加入雙鏈脫氧核糖核酸（doublestranded deoxyribonucleic acid、dsDNA）抗體，與辣根過氧化物酶進行標記后與抗原結合，最后加入底物3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺進行顯色，以顯色與否判斷是否為陽性[16]。

1.3.5 組織切片觀察

解剖小鼠取出小鼠的右腎，然后用10%福爾馬林進行固定。48 h脫水處理后，用石蠟包埋腎臟組織，再將包埋的組織進行切片，最后用蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，H&E）染料對切片染色后用顯微鏡觀察組織的病理學變化[17]。

1.3.6 qPCR分析

取0.1 g小鼠的左腎組織，然后加入0.9 mL生理鹽水進行勻漿。然后加入1.0 mL的RNAzol對組織中的RNA進行提取。測定RNA提取液的OD260nm/OD280nm，計算RNA純度和濃度，再將RNA提取液的質量濃度調整為1 μg/μL后進行反轉錄得到cDNA。將1 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix、7 μL 無菌蒸餾水、1 μL上游引物和1 μL下游引物進行混合，于定量PCR儀中進行反應（95 ℃、60 s；95 ℃、15 s；然后40 個循環：55 ℃、30 s；72 ℃、35 s；95 ℃、30 s；55 ℃、35 s），反應后用2-ΔΔCt法對相關基因進行計算和定量分析，以β-actin作為內參進行實驗，引物設計如表1所示[18]。

表1 本實驗中使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.3.7 Western blot分析

取0.5 g小鼠的左腎組織，加入1 mL放射免疫沉淀裂解液和10 μL苯甲基磺酰氟進行裂解，然后在4 ℃下12 000 r/min離心4 min，除去中間蛋白層溶液，然后用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量并將蛋白稀釋到質量濃度50 μg/mL。按4∶1體積比將稀釋的蛋白液與緩沖液混合后在100 ℃下保溫5 min，接著將混合液加入預制膠中進行垂直凝膠電泳，持續50 min后開始聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉膜。轉膜完成后用含1 mol/L Tris-HCl緩沖鹽溶液（Tris-HCl buffer salt with tween，TBST）的5%脫脂牛乳對PVDF膜進行1 h封閉，封閉完成后用TBST溶液洗膜。處理后的PVDF膜在25 ℃下于抗體稀釋溶液中浸泡，在1∶500（IL-4、IL-1β或TGF-β抗體與TBST體積比）稀釋的單克隆一抗中孵育2 h后再在1∶1 000（抗體與TBST體積比）稀釋的羊抗鼠IgG二抗中孵育2 h。最后用Supersignal West Pico PLUS對PVDF膜進行填充后置于成像系統中觀察[18]。

1.4 數據統計與分析

對待檢測的指標進行3 次的平行測定，實驗結果以平均值±標準偏差表示。使用單因素方差分析方法對數據進行差異顯著性分析，并用Excel 2016軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小鼠免疫器官指數分析結果

如圖1所示，通過計算小鼠的器官指數發現，正常組小鼠胸腺指數和脾臟指數高于其他各組，而模型組胸腺和脾臟器官指數則顯著低于其他各組（P＜0.05）。相比模型組小鼠，LLSLHFY14-L、LLSLHFY14-H和潑尼松均能夠使胸腺指數和脾臟指數顯著提高（P＜0.05），LLSLHFY14-H和潑尼松提高的程度高于LLSLHFY14-L。

圖1 小鼠的胸腺指數（A）和脾臟指數（B）Fig.1 Thymus (A) and spleen (B) indices in mice

2.2 小鼠血清中IL-2、IL-12、IFN-γ、TGF-β和IgG質量濃度分析結果

如圖2所示，模型組小鼠血清中的IL-2質量濃度和IL-12質量濃度顯著低于其他各組（P＜0.05），而IFN-γ、TGF-β質量濃度和IgG質量濃度顯著高于其他各組（P＜0.05）。正常組小鼠血清中的IL-2、IL-12、IFN-γ、TGF-β質量濃度和IgG質量濃度呈現出和模型組相反的趨勢，IL-2和IL-12水平顯著高于其他組，IFN-γ、TGF-β質量濃度和IgG質量濃度低于其他組。與模型組相比，LLSLHFY14能夠使狼瘡性腎炎小鼠血清中的IL-2、IL-12質量濃度升高并使TGF-β、IFN-γ、IgG質量濃度降低，且效果呈現劑量依賴性，高濃度的LLSLHFY14（LLSLHFY14-H）效果接近藥物潑尼松，能使IL-2、IL-12、IFN-γ、TGF-β和IgG的血清質量濃度趨于正常組水平。

圖2 小鼠血清中的IL-2（A）、IL-12（B）、IFN-γ（C）、TGF-β（D）和IgG（E）細胞因子水平Fig.2 Levels of IL-2 (A), IL-12 (B), IFN-γ (C), TGF-β (D) and IgG (E)in serum of the mice

2.3 小鼠血清中SCr、BUN、TC、TG、TP和ALB水平分析結果

如圖3所示，正常組小鼠血清中TP和ALB的水平與其他各組相比均呈現出顯著差異（P＜0.05）。模型組小鼠的TP和ALB水平顯著低于其他各組（P＜0.05），而SCr、BUN、TC和TG水平則顯著高于其他各組（P＜0.05）。LLSLHFY14-H組小鼠血清中的TP和ALB水平低于正常組和潑尼松組，高于模型組和LLSLHFY14-L組；而LLSLHFY14-H組的SCr、BUN、TC和TG水平高于正常組和潑尼松組，低于模型組和LLSLHFY14-L組。

圖3 小鼠血清中的SCr（A）、BUN（B）、TC（C）、TG（D）、TP（E）和ALB（F）水平Fig.3 Levels of SCr (A), BUN (B), TC (C), TG (D), TP (E) and ALB (F)in serum of mice

2.4 小鼠血清中dsDNA抗體的陽性率分析結果

在LLSLHFY14作用小鼠開始后的第2、4、6、8、10、12周對小鼠血清的dsDNA抗體進行檢測。正常組小鼠在整個實驗周期中血清dsDNA抗體均呈現陰性，第4周開始，模型組所有小鼠dsDNA抗體均呈陽性（表2），提示狼瘡性腎炎動物模型誘導成功。LLSLHFY14和潑尼松抑制了小鼠狼瘡性腎炎的陽性率，其中LLSLHFY14-H在4～6 周中呈現50%的陽性率，進入第10周后降低到40%，潑尼松在第6周呈現出50%的陽性率，隨之降低，進入第12周降為30%，LLSLHFY14-H和潑尼松均能使陽性率降低。實驗結果表明LLSLHFY14和潑尼松抑制了小鼠狼瘡性腎炎的發病，高濃度LLSLHFY14的效果接近潑尼松。

表2 狼瘡性腎炎小鼠血清的dsDNA抗體陽性率Table 2 Positive rates of anti-dsDNA antibody in serum of mice with lupus nephritis

2.5 腎組織的病理觀察

顯微鏡下觀察到正常組小鼠腎組織中細胞結構完整且腎小球形態正常，但是模型組小鼠腎組織中的腎小球出現包括破裂等形態的變化，同時腎臟細胞間還出現炎性浸潤，總體呈現出嚴重的腎組織病變（圖4）。潑尼松可以明顯地減輕腎臟組織的病變，高濃度的LLSLHFY14（LLSLHFY14-H組）也一定程度地減輕了腎組織的病變，能夠起到與潑尼松接近的效果。

圖4 小鼠腎臟組織的H&E染色病理觀察Fig.4 Pathological observation of mouse kidney tissues by H&E staining

2.6 小鼠腎組織的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量分析結果

如圖5所示，通過qPCR和Western blot實驗對小鼠腎組織的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量進行了檢測，結果顯示模型組小鼠腎組織中的IL-1β和TGF-β mRNA和蛋白相對表達量均顯著高于其他組（P＜0.05），但IL-4 mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于其他組（P＜0.05），正常組小鼠腎組織的IL-4 mRNA和蛋白相對表達量則均顯著高于其他組（P＜0.05），TGF-β和IL-1β mRNA和蛋白相對表達量均顯著低于其他組（P＜0.05）。相比模型組，LLSLHFY14-L、LLSLHFY14-H和潑尼松均能夠顯著上調狼瘡性腎炎小鼠腎臟組織的IL-4表達和下調IL-1β、TGF-β表達（P＜0.05），LLSLHFY14-H組和潑尼松組調控IL-4、TGF-β和IL-1β蛋白表達的能力無顯著差異（P＞0.05），但強于LLSLHFY14-L組。

圖5 小鼠腎組織中的IL-4、TGF-β和IL-1β mRNA相對表達量和蛋白相對表達量Fig.5 mRNA and protein expression of IL-4, TGF-β and IL-1β in mouse kidney tissues

3 討 論

狼瘡性腎炎是一種與機體免疫異常直接相關的疾病，會導致機體內免疫復合物、免疫細胞、免疫細胞因子等異常。免疫器官指數能夠直接反映小鼠內臟狀況，免疫器官指數的提升是實驗動物病癥減輕、機體得到恢復的表現[19]。胸腺和脾臟是機體免疫系統的重要器官，免疫性疾病小鼠的胸腺和脾臟指數都會出現顯著下降[20]。在本研究中狼瘡性腎炎也造成模型組小鼠胸腺指數和脾臟指數下降，LLSLHFY14和潑尼松干預狼瘡性腎炎小鼠后免疫失調得到抑制，胸腺指數和脾臟指數得到改善，特別是LLSLHFY14-H的效果接近藥物潑尼松的作用，使器官指數趨于正常狀態。

T細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞和B細胞廣泛分布在體內各個免疫器官和組織中，它們在機體內發揮重要的免疫調節作用。IL-2和IL-12可以增強T細胞活性，IL-12能夠協同IL-2增強機體免疫力[21-22]；同時IL-2還可以刺激NK細胞的分化和激活，還能促進B細胞的增殖和分化以及免疫球蛋白的產生[21]。研究顯示，腎小球損傷后免疫系統應激反應下，NK細胞和Th1急性反應下會產生大量的IFN-γ[23]。TGF-β在免疫調節中抑制免疫細胞活性和B淋巴細胞分化，對免疫系統的正常工作起到不利的影響[24]。IgG是機體內含量最高的一類免疫球蛋白，機體出現免疫性疾病的情況下血液中的IgG水平會異常上升，狼瘡性腎炎臨床患者的血清IgG水平也會表現出異常的升高[25]。IL-2、IL-12、IFN-γ、TGF-β和IgG的水平變化在本研究中顯著體現在狼瘡性腎炎小鼠血清中，LLSLHFY14的干預能夠抑制這些變化，改善小鼠的免疫失調，從而改善狼瘡性腎炎。

SCr與尿素氮都是含氮的有機化合物，作為蛋白質代謝在機體內的最終產物，通過腎小球正常過濾。但狼瘡性腎炎發病時，腎小球過濾的能力下降，SCr與尿素氮在血清中水平異常提高，所以SCr與尿素氮水平也被作為臨床診斷腎病的重要指標[26]。腎臟出現嚴重病變時會發生高鉀血癥，由此也會導致膽固醇與TG過度積累，這兩個指標也被認為是腎功能異常的重要臨床指標[27]。腎功能異常時會出現蛋白尿，造成血清中TP含量下降，同時還造成具有腎病治療作用的ALB的含量也降低，保持機體內的TP和ALB水平正常也是維持腎功能的重要干預途徑[28]。本研究中LLSLHFY14能夠調節腎功能異常后的異常血清水平，從而起到改善狼瘡性腎炎及其引起的腎功能異常的作用。狼瘡性腎炎中的另一個關鍵生理變化是發病后會特異性的表現出dsDNA抗體[29]，LLSLHFY14能夠降低dsDNA抗體的陽性率，起到干預狼瘡性腎炎發病的作用。

IL-4是重要的免疫調節物質，對B細胞和T細胞等免疫細胞都有調節作用，還可以對IFN-γ的mRNA轉錄起到抑制作用，從而起到緩解腎功能異常對機體造成的影響，改善免疫失調和腎功能異常[30]。IL-1β是免疫系統中的一個重要促炎因子，IL-1β過度產生是機體免疫應激反應和炎癥的重要表現，現已有研究顯示通過IL-1β受體拮抗劑調控IL-1β能夠減輕狼瘡炎癥[31]。TGF-β在機體內的過度表達將加劇腎臟病變，增加腎纖維化的可能性[32]。本研究也證實狼瘡性腎炎發病小鼠腎臟組織中的IL-4、TGF-β和IL-1β表達均出現異常，LLSLHFY14能夠顯著控制表達異常，從而起到改善腎功能的作用。

通過有益微生物干預狼瘡性腎炎的研究還較少，有研究通過Lactobacillus oris、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus johnsonii和Lactobacillus gasseri5 種有益菌灌胃小鼠干預狼瘡性腎炎，發現L.reuteri能夠改善小鼠腸道菌群，從而調節小鼠的免疫機能來起到干預狼瘡性腎炎的作用[33]，特別是這些有益微生物能夠調節小鼠機體的IL水平來調控IgG2a和免疫機能，本研究中LLSLHFY14也能夠對小鼠的多種IL（IL-1β、IL-2、IL-4和IL-12）水平起到改善作用，從而調節IgG水平和增強免疫機能。但是本實驗未對小鼠的腸道菌群變化進行深入研究，為了更深入闡明LLSLHFY14的作用機制，未來研究應進一步分析腸道菌群變化。

4 結 論

本實驗對一株來源于發酵牦牛酸乳的乳酸菌進行研究，對其在狼瘡性腎炎中的作用和機制進行了初步探討。研究結果顯示，LLSLHFY14對狼瘡性腎炎小鼠的免疫功能起到明顯的調節作用，可進一步改善狼瘡性腎炎引起的腎功能異常，其具備對狼瘡性腎炎進行長期干預改善腎功能的應用潛質，效果接近于藥物潑尼松。食品來源的微生物具有良好的安全性，LLSLHFY14具有作為益生菌發揮改善腎功能的應用價值，但仍需要人體臨床試驗來進一步深入驗證。