太平洋牡蠣冷藏過程中閉殼肌品質的變化

歐 韋，楊汝晴，張凌晶,2，孫樂常,2，翁 凌,2，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.大連工業大學海洋食品深加工協同創新中心，遼寧 大連 116034）

牡蠣俗稱蠔，是世界上第一大養殖貝類。2020年，我國牡蠣養殖產量達542.5萬 t，位居世界首位[1]。牡蠣口感鮮嫩爽滑，富含優質蛋白且營養成分易被機體吸收，深受廣大消費者喜愛[2]。但是，牡蠣由于水分含量高、pH值呈中性以及內源性酶活躍等特點，采收后容易發生腐敗變質，進而導致營養成分流失和商業價值降低，甚至對人體健康產生潛在威脅[3-4]。

冷藏是最廣泛使用的延長牡蠣保質期的手段。但是，隨著冷藏時間的延長，牡蠣品質會發生不可逆轉的劣化現象。與魚類相似，貝類在貯藏期間也同樣經歷軟化和腐敗，主要是由于其體內化學成分的變化和肌肉蛋白質的降解[5-6]。肌原纖維蛋白是肌肉蛋白的主要組成部分，對于貝類的品質起著至關重要的作用。Yin Zhongzhuan等[7]發現扇貝在冷藏過程中肌原纖維結構出現明顯的斷裂和卷曲，肌節消失。Xiong Xin等[8]研究發現隨著冷藏時間的延長，蝦夷扇貝肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）逐漸被降解，同時肌肉硬度、彈性和咀嚼性均發生顯著下降。水產動物冷藏過程中肌肉蛋白的降解通常是由內源性蛋白酶引起的,如皺紋盤鮑在冷藏過程中絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶L的活力逐漸升高[9]。Liu Bing等[10]發現在4 ℃冷藏過程中絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑能抑制扇貝肌肉中MHC的降解。因此認為絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶是導致貝類軟化的主要內源性蛋白酶。

目前，國內外對牡蠣的研究主要集中在育種養殖[11]、保鮮技術[12-13]及功能性食品牡蠣肽[14-15]等的方面，關于牡蠣蛋白在冷藏過程中的變化研究較少。隨著我國冷鏈物流業的快速發展以及消費觀念的改變，牡蠣冷藏運輸量逐年增加，對其在冷藏過程中的品質變化研究也顯得更加重要。本研究以太平洋牡蠣為研究對象，分析0 ℃和4 ℃冷藏過程中牡蠣4 個組織（外套膜、腮、內臟團、閉殼肌）中蛋白的降解情況，探究牡蠣在冷藏條件下理化性質指標、質構特性和蛋白降解相關酶（絲氨酸蛋白酶、組織蛋白酶B）活力的變化，重點從閉殼肌蛋白變化的角度揭示牡蠣在冷藏過程中品質變化的機理，旨在為牡蠣冷藏保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣，2021年10—12月間購于廈門高崎水產市場。去殼后牡蠣肉質量為（19.0±2.0）g。

Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA熒光底物日本Peptide Institute公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）青島福林生物化學公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、丙烯酰胺 美國Bio-Rad公司；兔抗人β-肌動蛋白（Actin）抗體 美國Cell Signaling Technology公司；兔抗藍圓鲹肌球蛋白抗體、兔抗鮑副肌球蛋白（paramyosin，PM）抗體和兔抗扇貝原肌球蛋白（tropomyosin，TM）抗體由本實驗制備；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG） 艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司；色譜級無水磷酸二氫鈉 上海麥克林公司；色譜級甲醇 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；色譜級磷酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他常規試劑如無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設備

PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26SXP高速冷凍離心機 美國Beckman公司；垂直電泳儀 美國GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；G:BOX凝膠成像儀 英國Synegene公司；半干式轉移電泳儀大連竟邁生物科技有限公司；成像分析系統 美國Azure Biosystems公司；pH計 上海奧豪斯儀器有限公司；1260液相色譜儀 美國Agilent公司；TA.XT plus/50質構儀 英國SMS公司；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 太平洋牡蠣預處理

鮮活太平洋牡蠣去殼，用經過濾的冰海水洗凈撈出后瀝干。自封袋密封后一半直接置于4 ℃冷庫，另一半置于盛有碎冰（0 ℃）的保溫箱后，于4 ℃冷庫貯存，每2 d更換碎冰。觀察表觀形態變化。

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

于第0、1、2、3、4、5、7、9、11天取在0 ℃和4 ℃貯藏的太平洋牡蠣，分離閉殼肌、外套膜、鰓、內臟團4 個組織。加入冰冷（4 ℃貯存）的4 倍體積緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0），組織搗碎2 min。向4 個組織的樣品中各加入2 倍體積的蛋白溶解液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，含8 mol/L尿素、1 g/100 mL SDS、體積分數2%β-巰基乙醇），95 ℃加熱20 min，用丙烯酰胺質量分數為10%的分離膠和質量分數為5%的濃縮膠對樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），分析蛋白條帶變化。

1.3.3 閉殼肌Western blotting分析

將第0、1、2、3、4、5、7、9、11天的閉殼肌樣品進行SDS-PAGE，蛋白通過半干式電轉印轉移至硝酸纖維素膜上。將膜以質量分數5%脫脂奶4 ℃過夜封閉，TBST清洗4 次，每次5 min，接著分別用兔抗藍圓鲹肌球蛋白抗體、兔抗鮑副肌球蛋白抗體、兔抗扇貝原肌球蛋白抗體和兔抗人肌動蛋白抗體孵育1 h，TBST清洗5 次，每次5 min，再用HRP標記的羊抗兔IgG孵育1 h，TBST清洗5 次，每次5 min，加入增強型化學發光（enhanced chemiluminesce，ECL）底物孵育2 min，利用成像分析系統測定。

1.3.4 冷藏過程中相關蛋白降解酶活力的測定

將冷藏不同時間的閉殼肌組織（3 g）搗碎后12 000 r/min離心15 min，上清液即為對應的粗酶液。在900 μL 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中加入50 μL粗酶液和50 μL 10 μmol/L的熒光底物，混勻。37 ℃孵育20 min，加入1.5 mL終止液（V（水）∶V（甲醇）∶V（異丙醇）＝35∶35∶30）終止反應。采用熒光分光光度計分別在激發波長380 nm、發射波長450 nm條件下測定產物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強度。絲氨酸蛋白酶的熒光底物為Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、組織蛋白酶B的熒光底物為Z-Arg-Arg-MCA。酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol AMC的量。

1.3.5 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》。稱取10.00 g絞碎的牡蠣肉，加入100 mL煮沸后冷卻的水，組織搗碎，靜置30 min后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取50 mL上清液于100 mL燒杯中，用pH計測定。同一個試樣測兩次，取平均值。

1.3.6K值的測定

取2.00 g太平洋牡蠣閉殼肌，加入質量分數10%10 mL高氯酸，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，向沉淀中加入5 mL質量分數5%高氯酸，均質，再次離心10 min，重復上述操作1 次，合并3 次的上清液，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0，再用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.4，整個過程在冰上進行。再次離心，超純水定容至25 mL，過0.22 μm水系膜，置于-80 ℃備用。

高效液相色譜條件[16]：色譜柱SHODEX Asahipak GS-320 HQ；流動相：V（205 mmol/L NaH2PO4）∶V（205 mmol/L H3PO4）＝300∶7；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量：20 μL。K值按下式計算。

式中：cATP、cADP、cAMP、cIMP、cHxR、cHx分別為三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤含量/（μmol/g）。

1.3.7 質構特性的測定

將太平洋牡蠣閉殼肌切成高度0.8 cm、直徑1.0 cm的肉柱，采用TA.XT plus/50質構儀測定閉殼肌TPA。測定條件：圓柱形探頭P/0.5，測定恒定速率1 mm/s，形變50%，兩次壓縮時間間隔5 s，接觸力為5.0 gf。測定的質構參數包括硬度、彈性、咀嚼性和內聚性。每個樣品平行測定3 次。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 18.0軟件進行單因素分析，利用Duncan檢驗進行差異顯著性分析，所有實驗數據均重復3 次進行測定。應用Origin 8.0軟件進行繪圖。圖片采用Adobe Illustrator CS5軟件進行標注。

2 結果與分析

2.1 太平洋牡蠣冷藏過程中的表觀變化

觀察牡蠣的表觀變化是檢測牡蠣新鮮度最直觀的方法。在0 ℃和4 ℃中，太平洋牡蠣的表觀變化如圖1所示。新鮮太平洋牡蠣閉殼肌呈透明狀、組織清晰、肉質緊實。外套膜呈黑色或黑褐色，鰓絲清晰可見，內臟團呈淡黃色或乳白色。在0 ℃貯藏7 d后，牡蠣閉殼肌肉質仍較緊實，冷藏11 d后閉殼肌變成半透明狀，肉質變軟。在4 ℃貯藏7 d后，閉殼肌色澤變成半透明狀，表面滲出較渾濁的黏液，第11天閉殼肌色澤呈不透明狀，肉質呈糊狀，表面出現黃色黏液。可見，隨著冷藏時間的延長，閉殼肌品質變化明顯下降，在保鮮效果方面，0 ℃貯藏明顯優于4 ℃貯藏。

圖1 太平洋牡蠣冷藏過程中的表觀變化Fig.1 Appearance changes of Crassostrea gigas during cold storage

2.2 太平洋牡蠣冷藏過程中全蛋白SDS-PAGE分析結果

通過SDS-PAGE得到太平洋牡蠣在0 ℃和4 ℃冷藏過程中全蛋白的變化情況。鹽溶性蛋白是牡蠣等貝類蛋白質的重要組成部分，主要由肌原纖維蛋白組成[17]。肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白（myosin）、PM、TM和肌動蛋白（actin）。由圖2可知，太平洋牡蠣閉殼肌主要含有MHC和Actin，在0 ℃冷藏期間牡蠣組織全蛋白無明顯變化。由圖3A可知，在4 ℃冷藏期間，閉殼肌在100～150 kDa之間的蛋白條帶逐漸出現降解，至第4天，37 kDa處左右出現降解條帶。而外套膜、鰓和內臟團無明顯降解條帶（圖3B～D）。表明太平洋牡蠣在4 ℃冷藏過程中，主要是閉殼肌中的蛋白發生了降解。

圖2 太平洋牡蠣0 ℃冷藏期間蛋白變化Fig.2 Protein changes in Crassostrea gigas stored at 0 ℃

圖3 太平洋牡蠣4 ℃冷藏期間蛋白變化Fig.3 Protein changes in Crassostrea gigas stored at 4 ℃

2.3 太平洋牡蠣閉殼肌Western blotting分析結果

為了進一步驗證在0 ℃和4 ℃冷藏期間閉殼肌中蛋白的降解情況，采用抗MHC、PM、TM和Actin的多克隆抗體進行Western blotting驗證。如圖4所示，0 ℃冷藏期間，閉殼肌MHC顯色條帶為兩條，分別在220 kDa和130 kDa左右，后者可能是牡蠣采收后MHC的降解產物。PM主要以多聚體的形式（aPM）存在，單體PM分子質量在97 kDa左右。太平洋牡蠣肌肉蛋白中有兩個蛋白與TM抗體發生了免疫交叉反應，分子質量為40 kDa左右，Actin的分子質量為45 kDa左右。太平洋牡蠣在0 ℃貯藏時，閉殼肌MHC在第3天120 kDa處出現降解條帶（圖4A），而PM、TM和Actin無明顯變化（圖4B～D）。由圖5可知，在4 ℃冷藏過程中，閉殼肌MHC在第1天120 kDa處出現輕微降解條帶，冷藏5 d后130 kDa左右處的條帶被完全降解，并在110 kDa處出現新的降解條帶（圖5A），而PM、TM和Actin無明顯變化（圖5B～D）。表明在4 ℃冷藏時，閉殼肌中MHC最先發生降解，對應SDS-PAGE結果。在冷藏過程中，太平洋牡蠣肌肉蛋白主要是MHC發生降解。

圖4 0 ℃冷藏期間太平洋牡蠣閉殼肌蛋白Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of adductor muscle protein in Crassostrea gigas stored at 0 ℃

圖5 4 ℃冷藏期間太平洋牡蠣閉殼肌蛋白Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of adductor muscle protein in Crassostrea gigas stored at 4 ℃

2.4 太平洋牡蠣閉殼肌冷藏過程中蛋白降解相關酶活力的變化

研究發現，蛋白酶對結構蛋白的降解導致肌肉質地劣化，絲氨酸蛋白酶主要降解肌原纖維和結締組織蛋白[10]，組織蛋白酶B也參與肌肉蛋白質的降解[18]。采用熒光光譜對冷藏期間太平洋牡蠣絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶活力進行測定，結果如圖6所示。在新鮮狀態下，絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B的活力均能被檢測到，初始酶活力分別為0.11 U/g和0.04 U/g。在0 ℃和4 ℃冷藏前、中期，絲氨酸蛋白酶活力總體呈現先升高后降低的趨勢，分別至第3天和第2天達到最大值。貯藏后期（第9天），絲氨酸蛋白酶活力升高可能是微生物的作用，但此時牡蠣已經超出可食用范圍。在0 ℃和4 ℃貯藏過程中，組織蛋白酶B的活力也分別在第3天和第2天達到最高。

圖6 太平洋牡蠣冷藏期間閉殼肌絲氨酸蛋白酶（A）和組織蛋白酶B（B）活力的變化Fig.6 Changes in serine protease (A) and cathepsin B (B) activities in the adductor muscle of Crassostrea gigas during cold storage

2.5 太平洋牡蠣冷藏過程中的理化性質

如圖7A所示，新鮮太平洋牡蠣pH值為6.79。在0 ℃冷藏11 d后，pH值為6.52。在4 ℃貯藏5 d后pH值明顯下降，到11 d下降至5.84。K值常作為評價食品鮮度的指標，在20%以下為新鮮，20%～40%為二級鮮度，可用于食品加工[19]。新鮮太平洋牡蠣K值為2.51%，冷藏過程K值不斷增大。如圖7B所示，在0 ℃貯藏時，牡蠣品質劣變較緩慢，在第7天時K值達到22.61%，在第9天時升至40.90%；在4 ℃貯藏3 d后太平洋牡蠣K值達到20.10%，至第5天時，K值為41.83%。從K值的變化可得出：太平洋牡蠣在0 ℃下貯藏的保鮮期比在4 ℃下貯藏更長。

圖7 太平洋牡蠣冷藏過程中pH值（A）和K值（B）的變化Fig.7 Changes in pH (A) and K value (B) of Crassostrea gigas during cold storage

2.6 太平洋牡蠣閉殼肌冷藏過程中質構特性的變化

質構是對產品結構或內部構造的感官解釋和表達，與產品對壓力和觸覺屬性的反應有關。因此，質構特性常用來表示一些機械特性，如硬度、彈性、咀嚼性和內聚性等[20]。包括肌原纖維蛋白和結締組織在內的結構蛋白與這些肌肉質構特性相關，因此肌肉的質構特性可用于評估產品的品質[10]。根據表1和表2可知，在0 ℃和4 ℃冷藏過程中硬度和咀嚼性呈先上升后下降的趨勢，均在第1天達到峰值，隨后逐漸下降，彈性不斷下降。由表1可得，在0 ℃冷藏期間，硬度和咀嚼性在第3天恢復到接近新鮮值，冷藏11 d后硬度、彈性、咀嚼性和內聚性分別下降25.5%、2.5%、35.3%和13.2%。根據表2可得，在4 ℃冷藏期間，硬度、彈性和咀嚼性的下降程度均比在0 ℃冷藏期間大，冷藏11 d后硬度、彈性、咀嚼性和內聚性較新鮮組分別下降47.4%、13.7%、51.5%和13.2%。以上結果表明，太平洋牡蠣閉殼肌質地在冷藏期間發生了明顯的劣化，表現為硬度、彈性和咀嚼性的下降。

表1 0 ℃冷藏下太平洋牡蠣閉殼肌的質構特性變化Table 1 Textural changes in Crassostrea gigas adductor muscle stored at 0 ℃

表2 4 ℃冷藏下太平洋牡蠣閉殼肌的質構特性變化Table 2 Textural changes in Crassostrea gigas adductor muscle stored at 4 ℃

3 討 論

作為牡蠣生產大國，我國用于加工的牡蠣量僅占總產量的30%～40%，大部分僅采用冷鮮初級加工[21]。與魚類一樣，牡蠣在冷藏過程中不可避免地會發生鮮度降低和品質劣化，其主要原因是體內發生一系列生化變化，導致肌肉蛋白質被分解成一系列的中間產物和可溶性含氮物，最終導致微生物大量繁殖，失去食用價值[22]。牡蠣可食用軟體部分主要是由閉殼肌、外套膜、鰓和內臟團組成，而閉殼肌總蛋白質含量顯著高于外套膜、鰓和內臟團[23]。本研究將太平洋牡蠣肉在0 ℃和4 ℃下進行冷藏，結果顯示隨著貯藏時間的延長，閉殼肌變化最明顯，肉質逐漸變軟，邊緣和表面開始變得模糊。同時通過對閉殼肌、外套膜、鰓和內臟團全蛋白進行分析，結果顯示4 個組織中閉殼肌中全蛋白有輕微分解。因此，牡蠣冷藏過程中主要是閉殼肌蛋白發生了降解，通過對閉殼肌的品質變化分析可作為評價牡蠣肉鮮度的指標。

牡蠣閉殼肌肌肉組成中以肌原纖維蛋白為主，肌原纖維蛋白是一種重要的結構蛋白，由細肌絲和粗肌絲構成，正常生理條件下兩種肌絲通過相互滑動來完成肌肉的伸縮運動[24]。細肌絲主要由Actin和TM組成。在無脊椎動物中，粗肌絲由PM和Myosin組成[25]。通過Western blotting檢測在0 ℃和4 ℃冷藏過程中MHC、PM、TM和Actin的變化，發現太平洋牡蠣閉殼肌中的MHC分別在第3天和第1天發生降解。海灣扇貝在冷藏過程中也有同樣的規律，隨著冷藏時間延長MHC逐漸發生降解[26]。牡蠣TM的含量較低，通過SDS-PAGE蛋白條帶無法觀察到。通過Western blotting檢測TM，發現其呈兩條帶，分子質量大約為40 kDa，與張凌晶等[27]關于太平洋牡蠣粗提TM的研究結果一致。水產品肌肉的K值和pH值與其新鮮程度密切相關。K值常作為評價水產品鮮度的指標。本研究發現，太平洋牡蠣在0 ℃和4 ℃貯藏過程中K值分別在第9天和第5天超過二級鮮度范圍。同時，冷藏過程pH值略微降低。由于機體的糖原被降解生成乳酸等酸性物質，造成肌肉的pH值下降，下降程度和肌肉中糖原含量有關，而貝類中糖原含量豐富[28]。

內源性蛋白酶對肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白的水解是水產品貯藏過程中肌肉軟化的主要原因[29]。閉殼肌硬度、咀嚼性在第1天達到峰值，隨著貯藏時間的延長結構蛋白被內源性蛋白酶降解，纖維間的間隙增大，結構疏松，導致硬度、彈性、咀嚼性和內聚性下降[30-31]。在貝類中，絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶與肌肉降解有關。游銀川等[9]發現皺紋盤鮑在冷藏過程中絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶活力逐漸升高，且純化的組織蛋白酶對肌球蛋白重鏈有一定的降解作用。任秋穎等[32]從蝦夷扇貝中純化的絲氨酸蛋白酶能顯著降解肌球蛋白重鏈。在0 ℃和4 ℃冷藏前期，太平洋牡蠣閉殼肌中絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B的活力呈現先升高后下降的趨勢，這與皺紋盤鮑[9]和蝦夷扇貝[32]中酶活力變化情況一致。組織蛋白酶B在閉殼肌中的活力較低，本實驗室前期研究發現太平洋牡蠣內臟團中組織蛋白酶B和L的活力較高，且組織蛋白酶L只在內臟團中表達[33]。冷藏前期蛋白酶（絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B）活力逐漸上升，可能是酶原在貯藏期間被激活，進而降解肌肉蛋白。冷藏后期蛋白酶活力上升可能是受到微生物的影響。綜上所述，牡蠣在0 ℃和4 ℃冷藏過程中內源性蛋白酶在肌肉軟化中發揮重要作用，可使肌原纖維蛋白發生降解，從而導致肌肉軟化。

4 結 論

在冷藏過程中，太平洋牡蠣閉殼肌中肌肉蛋白發生了降解，且主要降解蛋白為MHC。絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶的活性在貯藏初期逐漸升高，表明這些酶可能參與閉殼肌肌肉組織中MHC的降解，導致閉殼肌的軟化以及蛋白質成分降解，可能導致營養價值下降。同時，隨著貯藏時間的延長，閉殼肌中pH值逐漸降低、K值逐漸增加，且質構特性也隨之劣變。