毛竹ABCG基因鑒定及其表達模式研究

李紫陽 楊克彬 朱成磊 劉 燕 郭 棟 肖曉燕 高志民

（國際竹藤中心竹藤資源基因科學與基因產業(yè)化研究所，國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點實驗室，北京 100102）

ATP 結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）是生物體中最大的轉運蛋白家族［1］，該類蛋白利用ATP 水解產生的能量驅動物質運輸。ABC 轉運蛋白家族包括8 個亞家族，其中ABCG 是最大的亞家族［2］，該亞家族又分為白棕色復合體（whitebrown complex，WBC）和多效性耐藥復合體（pleiotropic drug resistance，PDR）。WBC 是半分子ABCG 轉運蛋白，具有一個核心單位；PDR 是全分子ABCG 轉運蛋白，具有兩個核心單位［3］。每個核心單位由兩個基本結構組成，即ABC 轉運蛋白特異性核苷酸結合域（nucleotide-binding domain，NBD）和疏水跨膜結構域（transmembrane domain，TMD）。NBD 是由大約200 個氨基酸殘基組成的保守區(qū)段，包含Walker A、Walker B、ABC signature 基序以及Q 環(huán)和H 環(huán)［4］，TMD 通常由4～6 個疏水的α-螺旋組成［5］。ABCG 在植物中已有廣泛研究，在植物激素運輸、表皮角質層形成、次生代謝產物分泌、抵抗生物和非生物脅迫等方面起重要作用［6］。

研究表明，植物通過表面形成角質層來保護自身免受外界侵害，而ABCG 參與植物表面物質形成的運輸，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtABCG1 和AtABCG16 參與花器官相關表皮的角質組分運輸［7］。ABCG 介導植株體內重金屬離子的外排，減少其對植物的毒害作用，如AtABCG36和AtABCG40可分別參與Cd2+和Pd2+的細胞外排［8-9］。ABCG 還可參與木質素單體的轉運，如AtABCG29是H型木質素單體香豆醇的轉運蛋白［10］。另外，ABCG 在植物體內廣泛參與多種激素的運輸，擬南芥中的ABCG25、ABCG30、ABCG31 和ABCG40 是脫落酸（abscisic acid，ABA）的轉運體，分別在植物不同組織部位起輸入或輸出ABA 的作用［11］。擬南芥ABCG36 和ABCG37 是兩個在根部高表達的蛋白，參與生長素前體吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）的運輸，調控細胞內生長素動態(tài)平衡［12-13］。植物激素作為協調植物細胞活動的一類小分子化學信號物質，可通過多種方式調節(jié)植物的生長發(fā)育，尤其是可以參與抵御逆境脅迫過程，其中ABA 發(fā)揮著重要作用［14-15］。另外，ABA可以調節(jié)木質素合成調控網絡中的遺傳調控因子，促進次生壁形成，從而提高抗逆性［16］。

毛竹（Phyllostachys edulis）屬于禾本科竹亞科剛竹屬，具有生長快、適應能力強的特點，在我國栽培面積大，占全國竹林總面積的72.96%［17］，且產量高，物理性能佳，是木材的良好替代品。低溫和干旱等脅迫因素是制約毛竹竹材和竹筍產量和質量的主要非生物因素，目前在毛竹中已鑒定到多個基因參與到抗逆過程中，如Phehdz1［18］、PeEXs［19］、NAC［20］、WRKY［21］等轉錄因子基因均受到低溫或干旱脅迫的誘導。然而，激素作為植物響應非生物脅迫的重要信號分子，目前在竹子中關于運輸的研究甚少，而ABCG 作為重要的激素轉運蛋白在竹子中的研究仍幾乎處于空白。因此，本研究以毛竹為對象，在全基因組水平篩選并鑒定ABCG基因成員，綜合分析其基因結構、蛋白保守結構域、進化關系以及其啟動子中的作用元件，利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術分析不同激素和非生物脅迫處理后ABA 運輸相關ABCG基因的表達模式，以期為深入研究ABCG 基因家族在毛竹激素運輸以及抗逆過程中的功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在人工氣候室條件下（溫度25 ℃，相對濕度80%，光16 h/暗8 h）培養(yǎng)毛竹實生苗，2個月時選擇長勢一致的幼苗，將其隨機分為三組。第一組用100 μmol·L-1的ABA 溶液對葉片進行噴施處理；第二組將實生苗放入4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫處理；第三組用20% PEG-6000 溶液澆灌至飽和，模擬干旱處理［22］。每個處理至少有20 株幼苗，且均包含3 次重復。分別在處理后0、3、6 h 后收集各組毛竹自上而下第2 片嫩葉，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。

以江西省南昌市野生毛竹林（115°46＇ E，28°45＇ N）中的毛竹筍為研究材料，選擇長勢良好的毛竹筍，采集代表竹筍生長趨勢的5 個不同高度（1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 m）的筍，選取地上第15 節(jié)間（毛竹成竹胸高處），取該節(jié)間的上部作為試驗材料。樣品經液氮處理后，存于-80 ℃冰箱，用于研究關鍵ABCG基因在不同高度筍中的表達模式。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛竹ABCG 基因家族成員的鑒定 分別從Rice Genome Annotation Project（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）和TAIR（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）數據庫下載水稻和擬南芥ABC 家族成員的氨基酸序列作為誘餌，在毛竹新版本基因組數據庫BambooGDB（http：//bamboo.bamboogdb.org/）中進行BLASTP 比對分析，利用HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART 數據庫（http：//smart.embl-heidelberg.de）對獲得的候選序列逐條進行蛋白保守結構域的鑒定分析，刪除沒有典型結構域——ABC transporter（PF00005）以及該結構域不完整的序列，得到毛竹ABC 家族成員。利用MEGA 7.0 軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統進化樹，重復次數為1 000，其他參數使用系統默認值［23］。并以水稻ABC 基因家族分類為依據［24］，對毛竹ABC 基因家族進行分類，最終得到毛竹ABCG亞家族成員。

利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）網站對毛竹ABCG 蛋白長度、分子量及等電點等理化性質進行分析，并使用Plant-mPLoc 在線網站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測毛竹ABCG的亞細胞定位，使用TMHMM Server v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構域。利用TBtools 分析毛竹ABCG 亞家族成員的基因結構，利用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數據庫對基因上游2.0 kb 序列進行順式作用元件和應答元件分析，通過在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/tools/meme）對毛竹ABCG蛋白的保守基序進行分析。

1.2.2 毛竹ABCG 亞家族成員系統進化分析 利用MEGA 7.0 內置的ClustalW 軟件對水稻的ABCG 氨基酸序列進行多序列比對分析，并構建NJ 系統進化樹，重復次數為1 000，其他參數使用系統默認值［23］。通過TBtools 內置的BLASTP 程序對毛竹和水稻ABCG 的氨基酸序列進行多向比對，參考文獻［25］設置參數，鑒定毛竹中以及毛竹與水稻中具有共線性關系的基因，使用TBtools內置的MCScanX 程序進行可視化。同時，利用TBtools對毛竹ABCG同源基因對之間的同義（Ks）和非同義（Ka）核苷酸替換率進行計算。

1.2.3 毛竹關鍵ABCG基因的表達模式分析 使用總RNA 提取試劑盒（簡石，中國）提取不同處理毛竹葉片、不同高度筍第15 節(jié)上部的總RNA，并反轉錄為cDNA，存于-20 ℃冰箱。利用Primer Premier 5 軟件設計毛竹ABCG基因序列特異的定量引物（表1），由北京睿博興科生物科技有限公司合成。使用qTOWER 熒光定量PCR 儀（耶拿，德國），以PeNTB為內參基因［26］，反應體系共10 μL：2×SYBR Ⅱ Green I Master 5.0 μL、正向和反向引物各0.2 μL、cDNA 模板0.8 μL、ddH2O 3.8 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火10 s，44 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析基因的相對表達量［27］，并使用OriginPro 軟件繪制表達量圖。

表1 qRT-PCR和載體構建所用引物Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR and vector construction

1.2.4 共表達網絡構建與酵母單雜交 根據毛竹木質化調控網絡［28］，利用現有毛竹不同高度筍的轉錄組數據，基于加權基因共表達網絡分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）構建以PeABCG15為核心的共表達網絡，篩選與之共表達的轉錄因子。根據PeABCG15啟動子序列以及轉錄因子基因PeKNAT3（PH02Gene30737）和PeMYB42（PH02Gene08 106）序列，利用Primer Premier 5軟件設計引物，用于目的序列擴增，并分別構建到pHIS2 和pGADT7-Rec2 表達載體中，命名為pHIS2-PeABCG15pro、pGADT7-Rec2-PeKNAT3和pGADT7-Rec2-PeMYB42，將pGADT7-Rec2-PeKNAT3 和pGADT7-Rec2-PeMYB42 分 別 與pHIS2-PeABCG15pro共轉化到Y187感受態(tài)中，同時設置陽性對照（pGADT7-Rec2-53+p53His2）與陰性對照（pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2、pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2），在 篩 選 培 養(yǎng) 基DDO（SD/-Leu/-Trp）上培養(yǎng)后，將其菌液點于含有3-AT 的TDO（SD/-Leu/-Trp/-His）上，倒置培養(yǎng)3～5 d，拍照記錄［29］。

2 結果與分析

2.1 毛竹ABCG亞家族成員鑒定與亞細胞定位預測

通過篩選鑒定得到毛竹ABC基因190 個，其中包含ABCG亞家族成員77個，根據BambooGDB數據庫中基因組裝名稱的順序依次命名為PeABCG1～PeABCG77。PeABCGs 的編碼序列（coding sequence，CDS）長度為891～4 866 bp，編碼蛋白氨基酸序列長度為296～1 621 aa，其對應分子量為32.93～180.64 kDa，理論等電點介于5.58～9.77之間，平均親水系數為-0.337～0.414。跨膜結構域預測顯示，有74 個PeABCGs編碼蛋白具有跨膜結構，跨膜結構域數量為3～14個不等，屬于跨膜蛋白。亞細胞定位預測顯示，有73個PeABCGs均定位到細胞膜上，同時有6 個（PeABCG1、PeABCG20、PeABCG33、PeABCG33、PeABCG34和PeABCG58）定位到葉綠體，3個（PeABCG30、PeABCG31和PeABCG69）定位到細胞質，1 個（PeABCG54）定位到細胞核。另外4 個PeABCGs（PeABCG3、PeABCG18，PeABCG23和PeABCG24）定位到葉綠體、細胞質或細胞核中。

2.2 PeABCGs基因結構及其編碼蛋白的motif分析

基因結構分析結果表明，不同PeABCGs差異明顯。外顯子數量最多的是PeABCG42（25 個），有3 個基因（PeABCG9、PeABCG62和PeABCG73）不含內含子，且各個成員之間的差異在于內含子和外顯子數量及所在位置不同（圖1-A）。單個內含子最長為19 736 bp，是位于PeABCG27的第16 個內含子。另外，22 個PeABCGs沒有非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR），剩余55個成員中有36個同時具有5＇ UTR和3＇ UTR，5個只有5＇ UTR，14 個只有3＇ UTR。Motif 分析結果表明，在PeABCGs 中共鑒定得到10 個motif（motif 1～motif 10）（圖1-B），其中motif 1、motif 2 和motif 7 是 共 有motif 基 序，并 按motif 2-motif 7-motif 1順序共同組成ABC家族的特征保守域——ABC transporter。另外，motif 9只存在于半分子的ABCG（WBC）中，而motif 3、motif 4、motif 6 和motif 8只存在于全分子的ABCG（PDR）中。基因結構和保守基序的差異表明，不同PeABCGs可能具有不同的功能。

圖1 PeABCGs基因結構及其編碼蛋白的保守基序Fig.1 Gene structures of PeABCGs and the conserved motifs of their encoded proteins

2.3 PeABCGs的系統進化分析

系統進化樹分析表明，所有毛竹和水稻的ABCGs分為WBC 和PDR 兩個亞組，毛竹中WBC 成員數量較多，為42 個，PDR 中有35 個（圖2-A）。為進一步分析PeABCGs 的進化情況，將PeABCGs 定位到scaffold 上并與水稻基因組進行共線性分析。結果發(fā)現PeABCGs共分布在23 個scaffold 上，其中47 個基因組成28 個共線性基因對（圖2-B）。Ka/Ks分析發(fā)現，毛竹共線性基因對的Ka/Ks均小于1，由此表明PeABCGs 在進化上經歷了較強的純化選擇。與水稻基因組進行共線性分析發(fā)現，有31 個OsABCGs 與50 個PeABCGs 之間存在共線性，共組成54 個共線性基因對，表明毛竹與水稻在進化上具有較近的親緣關系。

圖2 ABCG亞家族成員的系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analyses of the members belonging to ABCG subfamily

2.4 PeABCGs啟動子序列分析

為進一步研究PeABCGs基因家族成員對植物激素和非生物脅迫的響應，對基因上游啟動子中的順式作用元件和應答元件進行了預測分析。結果顯示，有8類作用元件與植物激素響應相關，如脫落酸響應元件ABRE，赤霉素響應元件TATC-box、GARE-motif和P-box，生長素響應元件TGA-element、AuxRR-core，以及茉莉酸甲酯響應元件TGACG-motif、CGTCA-motif等（圖3）。其中，ABRE出現在74個PeABCGs的啟動子中，且數量最多，如PeABCG3、PeABCG24、PeABCG45、PeABCG60、PeABCG61和PeABCG76具有10 個以上的ABRE。同時，另有3 類作用元件參與脅迫反應，如低溫響應元件LTR 和干旱響應元件MBS。由此表明，PeABCGs 的表達可能受到多種植物激素和逆境脅迫的影響，特別是ABA、低溫和干旱。另外，在14 個PeABCGs 中發(fā)現AC元件（AC-I和AC-Ⅱ），前人研究表明該元件存在于木質素生物合成相關基因的啟動子中，且是MYB 轉錄因子特異結合元件［30］，由此推測這些PeABCGs 可能參與了木質素的合成過程。

圖3 毛竹PeABCGs啟動子響應元件種類統計Fig.3 Statistics of response elements in the promoter of PeABCGs

2.5 ABA運輸相關PeABCGs的表達模式分析

根據擬南芥、水稻中運輸ABA的ABCG，在毛竹中鑒定到7個同源基因，即PeABCG7、PeABCG15、PeABCG17、PeABCG34、PeABCG46、PeABCG58和PeABCG65。qRTPCR 結果表明，在ABA 處理下，除PeABCG34未檢測到表達外，其余6 個PeABCGs 均呈上調表達趨勢。其中PeABCG7和PeABCG17呈持續(xù)上升表達趨勢，在處理6 h時表達量分別是處理前（0 h）的106倍和273倍，另外4個基因隨時間的延長呈先上升后下降的表達模式，在3 h時與處理前相比均顯著上調（P＜0.05）（圖4-A～G）。在低溫處理條件下，7 個PeABCGs 的表達量均受誘導。其 中PeABCG15、PeABCG17、PeABCG34和PeABCG65表達量持續(xù)上升，特別是PeABCG34，處理6 h后的表達量達到了處理前的33 倍，而PeABCG7、PeABCG46和PeABCG58則呈先上升后下降的表達模式，在3 h 時與處理前相比均顯著上調（圖4-H～N）。在干旱處理后，PeABCG17、PeABCG34和PeABCG46的 表 達 量 持 續(xù) 上升，且在6 h 時均顯著高于處理前，特別是PeABCG46，其上調幅度最明顯，表達量約為處理前的34 倍；PeABCG15和PeABCG65呈先上升后下降的表達模式，在處理3 h時其表達量顯著升高；而PeABCG7和PeABCG58的表達受到抑制，呈持續(xù)下降趨勢（圖4-O～U）。

圖4 不同處理下毛竹葉中PeABCGs的表達分析Fig.4 Expression analysis of PeABCGs in leaves of moso bamboo under different treatments

2.6 木質素合成相關基因PeABCG15表達分析

由上述結果可知，PeABCG15在各個處理下均呈現顯著變化，且PeABCG15啟動子中存在與木質素合成相關的AC 元件，因此對其進行表達調控研究。利用WGCNA 構建了以PeABCG15為核心基因的共表達網絡，并通過相關性分析篩選出與PeABCG15具有較高相關關系的56 個轉錄因子基因（相關系數大于0.90）（圖5-A）。這些轉錄因子基因分別屬于13個轉錄因子家族（如MYB、NAC、HB等），其中PeKNAT3和PeMYB42與PeABCG15的表達具有高度相關性（相關系數大于0.94），PeKNAT3和PeMYB42的同源基因在擬南芥中均參與調控木質素的生物合成［31-32］，分別克隆了啟動子序列（798 bp）以及PeKNAT3和PeMYB42的編碼區(qū)序列（912和795 bp），用于酵母表達載體的構建。

酵母單雜交試驗結果表明，陽性對照（pGADT7-Rec2-53+p53His2）、pGADT7-Rec2-PeKNAT3+pHis2-PeABCG15pro 和 pGADT7-Rec2-PeMYB42+pHis2-PeABCG15pro均能在TDO/3-AT培養(yǎng)基上正常生長，而陰性對照（pGADT7-Rec2-PeKNAT3+p53His2和pGADT7-Rec2-PeMYB42+p53His2）無法正常生長（圖5-B）。由此說明，PeKNAT3、PeMYB42 能夠與PeABCG15啟動子相結合。同時qRT-PCR結果顯示（圖5-C），PeABCG15隨著筍高度的增加呈上調的表達趨勢，峰值出現在8.0 m 竹 筍 中，PeKNAT3和PeMYB42的 表 達 趨 勢 與PeABCG15一致，特別是PeMYB42在8.0 m筍中較1.0 m筍上調了1 000 倍以上。由此推測，PeABCG15的表達可能與木質素的合成密切相關。

3 討論

在植物中，ABCG 是ABC 轉運蛋白家族中最大的亞家族［2］，毛竹中同樣如此，這表明ABCG 亞家族較其他亞家族的功能更為多樣，因此在毛竹生長發(fā)育過程中起著關鍵的作用。本研究鑒定到毛竹中有77 個ABCG 家族成員，明顯多于進化關系較近的二穗短柄草（44個）、水稻（50個）以及擬南芥（43個）等物種中的數量［33］，這可能與毛竹在進化過程中經歷了全基因組復制事件和基因家族擴張事件有關［34］。這兩種事件發(fā)生的原因很可能是毛竹在適應環(huán)境過程中需要更多物質來滿足自身的生長發(fā)育，進而需要更多的轉運蛋白作為支撐。另外，毛竹、水稻和擬南芥中所有無內含子的基因均屬于WBC［35］，這一結果表明無內含子基因可能是從一個共同的無內含子基因祖先進化而來，且具有相似的功能。

亞細胞定位預測結果表明PeABCGs 大多定位在細胞膜上，這與其他植物中的研究結果一致［1，33］。除此之外，還有個別成員定位到其他位置，如葉綠體上，由此推測這些成員可能運輸光合作用相關的底物。有研究表明，當植物處在缺鐵環(huán)境中時，通過AtABCG37的轉運功能可以及時補給含鐵的復合物供植物正常生長［36］。OsABCG9 在水稻（Oryza sativa）葉片表皮蠟質（角質層的組成成分）的運輸中發(fā)揮關鍵作用，與野生型相比，osabcg9-1突變體葉片上的蠟質總量減少了53%，且在osabcg9-2突變體葉片中完全消失。毛竹中的OsABCG9同源基因PeABCG6在葉片中的表達量較其他組織更高，推測該基因也可能與表皮蠟質的合成相關。

研究表明，植物存在依賴ABA 和不依賴ABA 兩種途徑響應滲透脅迫［37-38］，ABA 可以作為信號因子調控植物中木質素的生物合成［39］，高木質素含量能夠提高植物的木質化，從而增強植物抵抗脅迫的能力［16，40］。本研究中，6 個與ABA 運輸相關的PeABCGs 在ABA 以及低溫或干旱處理下均受到誘導，說明上述基因可能通過ABA介導參與抗逆；而PeABCG34經qRT-PCR幾乎未檢測到表達，且在ABA 處理下表達量未發(fā)生明顯變化，表明該基因可能不受ABA 調控。PeABCG15在ABA、低溫和干旱處理下均受誘導，推測該基因可能依賴ABA 參與毛竹的抗逆過程。研究表明，在擬南芥中AtABCG29 能夠轉運對香豆醇木質素單體，并影響木質素含量［10］。PeABCG15 是AtABCG29 的同源蛋白，在本研究中PeABCG15的表達隨筍高度的增加而顯著上升，同時前人研究表明筍單個節(jié)間同一位置的木質化程度隨筍高度的增加而加深［28］，且PeABCG15啟動子區(qū)域含有MYB 轉錄因子特異結合元件，推測該基因可能參與毛竹中木質素的生物合成。因此，PeABCG15可能在ABA 誘導下通過促進毛竹的木質化來發(fā)揮抵御逆境的作用，這與葡萄葉片木質化程度高抗旱性增強［41］，以及棉花中木質素含量增加從而保護細胞壁免受真菌的降解［42］等研究結果一致，但其在竹子中的具體生物學功能有待進一步驗證。

4 結論

本研究從毛竹中鑒定了77 個ABCG 家族成員，發(fā)現PeABCGs 的啟動子區(qū)域中含有多種參與激素、非生物脅迫響應的調控元件以及轉錄因子結合元件。根據各成員具有完整保守結構域的數量，將PeABCGs 分為WBC 和PDR 兩個亞組，分別包括42 和35 個成員。在ABA處理、低溫和干旱脅迫下，葉片中7個與ABA運輸相關的PeABCGs 的表達量變化模式說明，PeABCGs通過ABA 介導型和非介導兩種方式參與抗逆，其中PeABCG15的表達受ABA 誘導，且其在毛竹筍中的表達隨筍的木質化增加而上升，推測該基因可能通過促進木質素合成參與抗逆過程。