Brevibacillus brevis B011次級代謝物中抗青枯菌活性物質的純化鑒定及生物合成基因簇分析

周向平 陳 武 劉天波 王運生 王凱歌劉 峰 李小慧 袁志輝

（1湖南省煙草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；3湖南省煙草科學研究所，湖南 長沙 410004；4湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；5湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425199）

青枯病是由青枯勞爾氏菌（Rasltonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的一種毀滅性土傳病害，青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染包括茄科植物在內的400 多種植物［1］，包括重要的糧食、經濟和蔬菜作物。青枯病菌主要通過土壤傳播并侵染寄主根系，然后在導管中大量繁殖，使導管堵塞，水分運輸受阻，進而使地上部因缺水萎蔫而枯死［2］。細菌性維管束病害所具有的致病機理使青枯病難以防治，是農作物特別是茄科作物如番茄、辣椒、馬鈴薯和煙草等生產上的重要限制因子，已造成不可挽回的經濟損失［3-4］，使得青枯病成為世界上較為嚴重的植物細菌性病害之一。

二十世紀末至今，大量田間-溫室試驗已經廣泛評估了輪作、嫁接、土壤改良劑、土壤熏蒸、化學防治等方法對青枯病的防控作用［5］。但每種方法都存在明顯的缺陷，如輪作模式周期長，對灌溉資源要求高，會減少有效種植面積；土壤改良劑可選擇的種類少，對土壤結構破壞大，且防控效果不能滿足實際生產要求等。生物防治具有安全無公害、長效等優點，是當前防控青枯病的研究熱點，如賴寶春等［6］采用復合拮抗放線菌的方式防治番茄青枯病的盆栽防效可達82.03%；蔡傅紅等［7］采用的伊利石吸附W51 菌劑在溫室試驗中對番茄青枯病的防效為62.29%，表現出了較好的防治效果。生物防治的作用機制可分為競爭營養和生態位、分泌抑菌活性物質、寄生（寄生病原菌，如噬菌體等）和誘導寄主產生系統性抗性等，其中分泌抑菌活性物質被認為是生防菌抑制病原菌的主要作用機制［8］。

前期研究結果表明，湖南農業大學植物保護學院作物病蟲害防控實驗室從煙草根系土壤中篩選到的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）B011 的無菌發酵液對青枯病菌有良好的拮抗活性，說明B011具有合成并分泌抑菌活性物質至胞外的能力。拮抗菌的抑菌活性物質主要來源于核糖體合成和非核糖體合成兩大途徑［9-10］。目前，從短短芽孢桿菌中純化并鑒定的具有抑菌活性的次生代謝產物主要是抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）和非核糖體肽（non-ribosomal peptides，NRPs）［11-12］。其中，典型的AMPs均由核糖體合成，包括側孢霉靈（laterosporulin）、側孢霉靈10（laterosporulin10）和Bac-GM100 等［11］。NRPs 則包括線性NRPs （linear NRPs）、環狀NRPs （cyclic NRPs）、線性脂肽（linear lipopeptides）和環脂肽（cyclic lipopeptides）等四類數十種化合物［11-12］。從數量上看，短短芽孢桿菌合成的主要抑菌活性物質是非核糖體肽類抗生素，其次是傳統的抗菌肽［13］。

在短短芽孢桿菌抑菌活性物質的相關研究中，一般止于分離和結構鑒定，對其合成基因和途徑的預測和研究較少。因此，本研究采用陽離子交換樹脂柱對B011的發酵液中的抑菌活性物質首先進行粗分離與富集，然后通過高效液相色譜法進一步分離純化抑菌活性物質，再利用質譜與核磁波譜法解析其結構，最后根據基因組序列預測活性化合物的生物合成途徑及其相關基因，以期建立抑菌活性物質和編碼基因簇的對應關系，為后續解析其生物合成途徑及通過合成生物學方法進行定向改造奠定基礎，也為探討抑菌活性物質在作物病害生物防治方面的應用前景提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearumGMI1000）由湖南農業大學植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室提供。短短芽孢桿菌B011（Brevibacillus brevisB011）為湖南農學大學植物保護學院作物病蟲害防控實驗室（本實驗室）自行分離、鑒定和保存的菌株。

1.2 儀器和材料

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、甲醇、乙腈、無水乙醇、甲酸、三氯乙酸、異丙醇、氫氧化鈉和鹽酸等均購自中國醫藥集團有限公司（北京），其中甲醇和乙腈為色譜純，其他均為分析純。

改良NA培養基（NB固體培養基：牛肉膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂粉15 g、加蒸餾水定容至1 000 mL、pH值7.2）用于培養短短芽孢桿菌菌株B011。

高效液相系統：50 mm×250 mm DAC Column 和LC6000 型制備高效液相色譜儀（色譜儀配備P6000 高壓制備泵和紫外檢測器），北京創新通恒科技有限公司；C18HC 色譜柱、C18M 開放柱，北京華譜新創科技有限公司；HPLC-QTOF/1290-6530 液相質譜聯用儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 菌種的發酵及發酵液前處理

將B011 在NA 培養基上劃線活化，挑單菌落接種NB液體培養基，30 ℃、180 r·min-1條件下過夜培養后按5%的接種量將種子液接種于50 L 發酵罐（35 L 培養基），30 ℃、160 r·min-1條件下發酵培養48 h 后放罐。B011發酵液選用截留孔徑為5 kDa的中空纖維素膜過濾，同時去除菌體和分子量大于5 kDa的物質。

1.4 B011發酵液中抑菌活性物質的分離、純化與鑒定

將處理后的發酵液上陽離子交換樹脂柱，吸附材料為D113大孔弱酸性陽樹脂。洗脫體系由6個步驟組成：①用3.7 mol·L-1HCl溶液活化大孔吸附樹脂，隨后用蒸餾水沖洗至pH 值呈中性；②再用2～3倍柱體積的1.00～1.25 mol·L-1NaOH 活化樹脂，隨后用蒸餾水沖洗至pH值呈中性；③將經中空纖維素毛細管膜過濾后的發酵液上柱，棄濾過液；④用0.1%甲酸溶液沖洗大孔吸附樹脂柱，棄濾過液；⑤用5%甲酸溶液洗脫，收集洗脫液，閃蒸或噴霧干燥，即為抑菌活性物質的粗分離樣品，避光低溫保存備用；⑥按第①和第②步驟活化樹脂，進入下輪處理。

1.5 抑菌活性物質的純化與鑒定

將B011發酵液的粗分離凍干粉溶于去離子水超濾，上樣于H型陽離子交換樹脂，洗脫劑依次為去離子水、1%氨水、3%氨水。對青枯菌的抑菌活性測試結果表明，3%氨水部分為具有抑菌活性的餾分。隨后將餾分凍干粉溶于工業甲醇中，抽濾后過C8M開放柱，流動相為甲醇。收集液濃縮，去離子水復溶，鹽酸調pH值至中性。選擇復雜度較低的組分進行活性物質的分離純化。用分析型C18HC 色譜柱進行分離，流動相為乙腈-0.2%三氟乙酸水、流速（0.65 mL·min-1）和進樣量100 μL、紫外檢測波長為272 nm。按色譜峰分段收集具有抑菌活性的餾分；減壓濃縮和冷凍干燥后得到高純度的化合物1。流速和進樣量保持不變，流動相變更為20%乙腈-0.2%三氟乙酸水，收集單色譜峰餾分，減壓濃縮和冷凍干燥后得到高純度的化合物2。以煙草青枯菌為靶標，采用濾紙片法檢測化合物活性。

以煙草青枯病菌為靶標菌，通過濾紙片法觀察兩個化合物的抑菌活性。化合物1 為水溶液，化合物2 為10%二甲基亞砜水溶液（體積百分比）；化合物1號樣品濃度為0.4 mg·mL-1，化合物2號樣品濃度為10 mg·mL-1；陰性對照分別為水和10%二甲基亞砜水溶液；陽性對照為B011無菌發酵液，每張濾紙片上載樣量為10 μL。

采用液相質譜聯用儀分別對純化獲得的兩個抑菌活性物質進行三重串聯液質分析（liquid chromatography tandom mass spectrometry，LC-MS/MS）。采用BRUKER AVANCE III 600MHz核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）電噴霧質譜法（electro spray ionization mass spectrometry，ESI-MS）對2個抑菌活性物質進行核磁波譜分析（委托青島菲優特檢測有限公司開展），儀器的參數設置按說明書執行。

1.6 活性物質生物合成基因簇的分析

本實驗室前期已完成B.brevisB011 基因組測序，GenBank 登錄號為CP041767。用antiSMASH（http：//antismash.secondarymetabolites.org/）［14］在線對B011 基因組進行次生代謝產物合成基因簇預測，將已經注釋好的B011基因組序列（gbk格式）在線提交到antiSMASH數據庫查詢，antiSMASH 通過blast 搜索和FPAM 結構域預測，然后與數據庫中已知的次生代謝產物合成基因庫進行匹配，根據基因序列的相似性和基因排列順序進行預測。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

2.1.1 化合物1 在ESI-MS：正離子模式下，該化合物的準分子離子峰［M+H］+為755.440 6（圖1），推測分子式為C33H58N10O10，實測值與理論值偏差僅為0.78。

圖1 化合物1的一級和二級質譜圖Fig.1 Mass spectrometry of compound 1

根據一級和二級質譜中各片段分子量的大小，推測化合物1的裂解方式如圖2所示。

圖2 根據一級及二級質譜結果推測的化合物1的結構Fig.2 The diagram structure that deduced by mass and tandem mass spectrometry of compound 1

該化合物的一維核磁共振數據歸屬如表1 所示，其核磁共振譜數據與文獻［15］的報道基本一致。

表1 Edeine A的核磁信號Table 1 Results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of edeine A

綜合質譜及核磁波譜測試結果，將目標化合物鑒定為伊短菌素A（edeine A），其結構如圖3 所示。該化合物外觀為白色粉末，分子式為C33H58N10O10，分子量為754.87。

圖3 Edeine A的一級結構Fig.3 Structure of edeine A

2.1.2 化合物2 該化合物LC-MS/MS的一級及二級質譜圖如圖4所示。

圖4 化合物2的一級和二級質譜圖Fig.4 The mass and tandem mass spectrometry of compound 2

正離子模式下，準分子離子峰［M+H］+的m/z為203.105 2，［2M+H］+的m/z為405.202 6；負離子模式下，準分子離子峰［M-H］-的m/z為201.104 7，推測分子式為C12H14N2O（圖5）。

圖5 根據一級質譜和二級質譜推測的化合物2的一級結構Fig.5 The structure that deduced by mass and tandem mass spectrometry of compound 2

該化合物的一維核磁共振數據歸屬如表2 所示，其核磁共振譜數據與文獻［16］的報道基本一致。

排除雜質信號后，13C NMR 中共有12個信號：高場區3 個碳信號，1 個亞甲基信號δ 39.6 被溶劑峰掩蓋，但可以通過DEPT135°找到，另外兩個碳信號δ 22.7和25.3分別為甲基和亞甲基信號；低場區有9個碳信號，δ 169.1 歸屬于酰胺羰基，其余5 個叔碳和3 個季碳均為芳環上的碳原子。

排除雜質信號后，1H NMR中共有10組信號：δ 10.83（1H，br s）和7.98 （1H，br s）為亞胺活潑質子信號；高場區δ 1.81（3H，s）為孤立甲基質子，δ 2.81（2H，t，J=7.5 Hz）和δ 3.31 （2H，dt，J=6.0，7.5 Hz）為兩組亞甲基；低場區有5組芳基質子。

COSY 譜中給出了一系列質子間的相關信息，δ 2.81 和3.31 的相關信號表明兩者是A2B2系統中的一對亞甲基，同時δ 3.31與氨基的活潑質子相關，表明該亞甲基與氨基直接相連；不飽和區δ 7.14（1H，br d，J=2.1 Hz）僅與五元吡咯環亞胺質子相關，歸屬于氮原子的α 位；δ 7.52 （1H，d，J=7.8 Hz）與6.98 （1H，dt，J=0.8，7.8 Hz）、7.06 （1H，dt，J=0.8，7.8 Hz）、7.342 （1H，d，J=7.8 Hz）的連續相關信號表明其歸屬于鄰位而取代苯的四組芳基質子。

HMBC 給出質子與碳原子的遠程相關信息，芳環上的相關關系符合“間位相關”規律，重要的相關關系如圖6所示。

圖6 質子與碳原子的間位相關關系圖Fig.6 The correlation diagram between proton and carbon atoms

綜上所述，化合物2 的一級結構鑒定為N-乙酰基色胺［N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide］，結構如圖7。該化合物外觀為白色粉末，分子式為C12H14N2O，分子量為202.25。

圖7 N-乙酰基色胺的一級結構Fig.7 Structure of N-methylacetylchromate

2.2 化合物的抑菌活性驗證

測試結果如圖8 所示，濃度為0.4 mg·mL-1的化合物1 的抑菌圈明顯大于B011的無菌發酵液，而濃度為10 mg·mL-1的化合物2的抑菌圈小于B011的無菌發酵。說明化合物1是B011合成的主效抑菌活性物質，而化合物2是次要的抑菌活性物質。

2.3 生物合成基因簇分析

2.3.1 次生代謝產物基因簇預測 經antiSMASH 預測，在生防菌B011 基因組中共找到11 個可能與合成活性次生代謝產物有關的基因簇。其中酪氨酸、短桿菌肽（gramicidin）、伊短菌素（edeine）和petrobactin的合成基因簇都存在于B011 基因組中，且基因簇結構完整。從其分布來看，這些基因簇趨向于分布在一起，如酪氨酸、短桿菌肽（gramicidin）、伊短菌素（edeine）、petrobactin等在基因組上均分布在復制終止子附近。

edeine合成基因簇一共包含17個基因，即edeA～edeQ，其中edeA～edeP位于同一條鏈，預測屬于同一操縱子，而edeQ與其方向相反，位于另一條鏈上（圖9）。與菌株VM4和X23相比，生防菌B011基因組中存在更完整的edeine基因簇，且基因簇中的基因結構完整，基因序列高度保守，在基因編碼區和操縱子上游調控區存在一些單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

圖9 不同菌株基因組中Edeine合成基因簇比較分析Fig.9 Comparative analysis of Edeine syntheses gene cluster from different Brevibacillus strains

2.3.2 N-乙酰基色胺的生物合成途徑預測及編碼基因分析 在產色胺的蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereusKVT中，色胺是經由色氨酸脫羧形成的，由色氨酸脫羧酶（tryptophan carboxy lyase）催化產生［17］。故推測在B011菌株中，乙酰色胺的轉化途徑是色氨酸→色胺→乙酰色胺（圖10），關鍵點由兩個酶控制：芳香族氨基酸脫羧酶（aromatic-L-amino-acid decarboxylase，AADC，EC 4.1.1.28）和乙酰轉移酶（N-acetyltransferase，EC 2.3.1.5）。

圖10 N-乙酰基色胺的生物合成途徑預測Fig.10 Biosynthetic pathway prediction of N-acetyltryptamine

在B011基因組中，預測到17個脫羧酶（decarboxylase）編碼基因，與參考基因組B.brevisNBRC 100599 比，這17 個基因都能找到相應的同源基因（電子附表1）。脫羧酶（紅色）和乙酰轉移酶（藍色）的編碼基因在基因組上的位置標注如圖11，紅圈表示與參考基因組（NBCR100599）比較，顏色越深表示越保守，內圈為GC偏倚（GC Skew）。但這17個脫羧酶基因的注釋中并沒有芳香族氨基酸脫羧酶功能。同時，本研究在B011基因組中共找到54個乙酰轉移酶（acetyltransferase）編碼基因的同源基因（電子附表2），其中包括多個氨基酸乙酰轉移酶和精胺/亞精胺乙酰轉移酶的功能注釋，但由哪一個乙酰轉移酶負責將乙酰基轉移給色胺尚不清楚。

電子附表1 B011基因組中17個脫羧酶編碼基因的同源基因信息Electronic Table S1 Homologous gene information of 17 decarboxylase coding genes in B011 genome

電子附表2 B011基因組中54個乙酰轉移酶編碼基因的同源基因信息Electronic Table S2 Homologous gene information of 54 acetyltransferase coding genes in B011 genome

電子附表2（續）

圖11 色氨酸脫羧酶（紅色）和乙酰轉移酶（藍色）編碼基因在B011基因組上的位置Fig.11 Site information of Homologous gene of decarboxylase（red）and acetyltransferase（blue）in Br.brevis B011 genome

表2 根據HSQC歸屬的化合物2一維核磁數據Table 2 Results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of compound 2

3 討論

本研究采用膜過濾和多相色譜等手段，從B011菌株代謝產物中分離純化得到兩個單體化合物，通過高分辨質譜數據和1D、2D 核磁共振譜數據分析，將化合物1鑒定為edeine A，將化合物2鑒定為N-乙酰基色胺。以青枯病菌菌株為指示菌的平皿對峙結果表明，edeine A和N-乙酰基色胺對青枯病菌均有抑菌活性，但前者在低濃度下即具有良好的抑菌活性，是B011分泌的主效抑菌活性物質；而后者在濃度高達10 mg·mL-1時才對青枯病菌有抑菌活性，說明N-乙酰基色胺是B011 分泌的次效抑菌活性物質。

edeine A 是線性非核糖體肽，由4個非蛋白氨基酸［（S）-Tyr/phe、S-Ise、S-A2pr 和（2R，6S，7R）-A2ha］和1個聚胺（N端）組成。edeine是一種廣譜的抗生素，對細菌、真菌、支原體和腫瘤細胞均具有抑制活性和免疫調節活性［18-20］，且活性較穩定［21］，在農作物病害防治中有良好的開發與應用前景。edeine家族化合物的抑菌機制具有明顯的濃度依賴性，低濃度（＜15 μg·mL-1）下抑制DNA 合 成，高 濃 度（＞150 μg·mL-1）抑 制 蛋 白 質 合成［22］。edeine家族化合物的活性與其氨基酸組成密切相關，Czajgucki 等［19］以edeine A/D 為模板，合成了4 個結構類似物，結果發現，將（2R，6S，7R）-A2ha 替換成（3R，4S）-A2ho或（3R，4S）-A2hp后抑菌活性完全喪失，說明（2R，6S，7R）-A2ha 是影響edeine 家族化合物生物學活性的關鍵氨基酸之一。這些研究均表明edeine A具有良好的研究和應用價值，同時其活性也可通過結構改造/修飾進行調節。

N-乙酰基色胺可由細菌及真菌合成。前人從放線動孢菌屬真菌（Actinokineosporasp.）［14］和被毛孢屬（Hirsutellasp.）［23］真菌的發酵液中都純化到該化合物，且分離到的N-乙酰基色胺具有較強的清除自由基的活性。Pubchem 檢索結果表明，N-甲基乙酰色胺（C12H14N2O）不僅可以與甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor）和類固醇受體（steroid receptor）結合并抑制受體的活性，還是線粒體分裂（mitochondrial division）或線粒體融合（mitochondrial fusion）的抑制劑，因此現有研究主要是將N-乙酰基色胺作為藥物中間體或前體合成重要的活性化合物或活性天然產物［24］。同時，該化合物對絲狀真菌［25］和革蘭氏陽性細菌［26］也有抑制活性，但其對革蘭氏陰性細菌特別是青枯病菌的抑制活性尚鮮見報道。因此，本研究結果可為N-乙酰基色胺的應用范圍拓展和青枯病防控分子的發掘提供理論基礎。

本研究分離得到的這兩種化合物的生物合成已有少量報道，但對其合成途徑目前仍不完全清楚。edeine A的生物合成基因簇在B.brevisVm4［27］、X23［28］和本研究B011的基因組中均已預測到，一些合成調控因子也進行了研究［28-30］，但對其詳細的合成機制還缺乏深入研究。N-乙酰基色胺是bacillamides家族前體化合物［31］，對其家族成員化合物如bacillamide C 合成途徑的研究［30］有助于闡明N-乙酰基色胺的生物合成機制。N-乙酰基色胺的異源合成［32］也證實了本研究提出的N-乙酰基色胺合成途徑，但在B.brevisB011基因組中沒有預測到在其合成中起催化作用的芳香族氨基酸脫羧酶［32］和芳烷基胺N-乙酰轉移酶［24］編碼基因，色氨酸脫羧反應是由這其中某個基因的編碼產物催化，還是由其他因子催化有待進一步研究。因此在B011 菌株中N-乙酰基色胺由哪些基因編碼的產物催化合成還有待進一步研究。同時，在B011 基因組中的54 個乙酰轉移酶（acetyltransferase）編碼基因，具體由哪一個乙酰轉移酶負責將乙酰基轉移給色胺尚不清楚，下一步擬在外源添加色胺的前提下進行B011的表達譜分析，并結合基因敲除及逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）等手段進行驗證，以解析N-乙酰基色胺的生物合成途徑。

4 結論

本研究發現短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）B011 菌株發酵液中拮抗青枯菌的主效活性物質是伊短菌素A（edeine A），次效活性物質是N-乙酰基色胺［N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide］。B011 菌 株基因組中有結構完整的edeine 生物合成基因簇，一共包含17 個基因，序列高度保守；含有乙酰色胺合成途徑中關鍵酶芳香族氨基酸脫羧酶和乙酰轉移酶的多個同源編碼基因。