河北省不同苘麻種群對莠去津的抗性水平及抗性機制研究

郭倩穎 李 哲 馬樹杰 王明思 楊 娟，* 張利輝，*

（1河北科技師范學院，河北省作物逆境生物學重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2河北農業大學，植物保護學院，河北 保定 071000）

苘麻（Abutilon theophrastiMedicus）是錦葵科一年生雜草，危害玉米、大豆等作物，通過競爭光照、水分和養分而造成作物減產［1-2］。苘麻結籽量大，種子活力高，防控難度較大［3-4］。近年來，農田耕作制度改變和除草劑單一使用，使雜草群落的演替加快，目前苘麻的發生和危害處于上升態勢，已逐漸成為玉米田的惡性雜草。

莠去津（atrazine）屬于光系統Ⅱ（photosystem Ⅱcomplex，PSⅡ）抑制劑，能夠有效防除玉米田一年生禾本科雜草和闊葉雜草，其對某些多年生雜草也有一定的防除效果且因莠去津既能被雜草根吸收，也能被莖葉吸收，常作為土壤封閉除草劑和苗后莖葉處理劑使用［5］。但長期大面積使用，加速了抗莠去津雜草生物型的出現，自1972 年美國馬里蘭州首次發現綠穗莧（Amaranthus hybridusL.）對莠去津產生抗性以來，全球共發現抗莠去津雜草生物型66 個，從數量上僅次于乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑類除草劑的雜草抗性生物型［6］。雜草對除草劑的抗性機制可分為非靶標抗性（non-target-site-based resistance，NTSR）和靶標抗性（target-site resistance，TSR）［7-8］。非靶標抗性包括減少雜草對除草劑吸收和傳導，增強解毒代謝作用以及對除草劑的屏蔽或隔離作用等［9］。我國遼寧地區的苘麻種群對莠去津產生了較低水平抗性，抗性指數為1.7～4.0［10］。此外，硬直黑麥草（Lolium rigidumGaud.）對莠去津產生抗性是由于體內P450s代謝作用增強所致［11］。長芒莧（Amaranthus palmeriS.Watson.）抗性種群谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione Stransferase，GST）對莠去津的代謝速度比敏感種群快，導致其對莠去津產生抗性［12］。靶標抗性機制主要是除草劑作用位點的基因發生突變，或者靶標酶過度表達［13］。藜（Chenopodium albumL.）［14］、早熟禾（Poa annuaL.）［15］由于psbA基因編碼的氨基酸突變（Ser264Gly）導致其對莠去津的吸收能力減弱，從而產生抗性。

近年來，農業生產上莠去津對苘麻的防治效果不佳，田間推薦劑量不能有效防除苘麻，但目前在我國鮮見解析苘麻對莠去津抗性機制的相關報道。因此，本研究以采自河北省玉米田的6 個苘麻種群為研究對象，通過整株生物測定法測定苘麻種群對莠去津的敏感性差異，以明確其抗性水平；并從非靶標抗性和靶標抗性兩方面對抗性種群的抗性機制進行分析，以期為河北省玉米田苘麻的抗藥性治理和延緩抗性雜草發生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試苘麻種子 于2020年秋季和2021年秋季在河北省不同典型地區的玉米田單株采集6 個苘麻種群種子（具體采集信息見表1），晾干后放于4 ℃條件下儲存備用。

表1 苘麻種群采集地點Table 1 Collection locations of A.theophrasti populations

1.1.2 藥劑及試劑 38%莠去津懸浮劑（山東濱農科技有限公司），植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化技術有限公司），DNA 凝膠回收試劑盒、總RNA 提取試劑盒II R6934［安諾倫（北京）生物科技有限公司］，Hieff qPCR SYBR?Green Master Mix（High Rox）熒光定量PCR 試 劑 盒Hifair?Ⅱ 1st strand cDNA Synthesis Supermix for qPCR（上海翊圣生物科技有限公司），大腸桿菌TG1感受態細胞（北京博邁德生物技術有限公司），95%馬拉硫磷原藥（安徽瑞辰植保工程有限公司），98%NBD-Cl（上海麥克林生化科技有限公司），酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）試劑盒、植物谷胱甘肽-S-轉移酶、植物細胞色素P450氧化酶（黃石市藍圖生物科技有限公司）。

1.1.3 試驗儀器 3WP-2000 型行走式噴霧塔（農業農村部南京農業機械化研究所），梯度PCR 儀、ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國應用生物系統公司），DYY-6C 型電泳儀電源、DUT-48 切膠儀（杭州米歐儀器有限公司）。

1.2 苘麻種群幼苗培養

將營養土∶蛭石按1∶1的比例攪拌均勻，裝入7 cm×7 cm×10 cm 花盆中，將上述花盆放入塑料托盤中，灌水，使花盆吸水備用。挑選飽滿種子，使用70%酒精浸泡10 min 對種子進行消毒，然后用無菌水沖洗3 次。將種子放入60 ℃水浴鍋加熱30 min，取出后加入300.00 mg·kg-1赤霉素浸泡，放入培養箱（溫度：25～28 ℃，濕度：60%～70%，光照/黑暗：14 h/10 h）。待種子露白后播種到花盆中，每盆5 顆種子，覆土1 cm，24 h后采用3WP-2000 型行走式噴霧塔進行苗前土壤噴霧處理。

1.3 試驗方法

1.3.1 苘麻種群對莠去津的抗性水平測定 采用整株測定法，按1.2 所述方法種植6 個苘麻種群，38%莠去津懸浮劑施藥劑量為997.50、1 995.00、3 990.00、7 980.00、31 920.00 和63 840.00 g·hm-2，每個處理重復3次，同時設清水對照。施藥后觀察苘麻對莠去津的反應癥狀，21 d后剪取所有處理的苘麻植株地上部分，稱量鮮重，計算處理占對照鮮重百分比，繪制劑量-反應曲線，計算抑制生長中量GR50及抗性倍數（resistance index，RI）。計算公式如下：

式中，X為莠去津使用劑量；YX為施用劑量為X時苘麻地上部鮮重；Y0為不用藥對照組苘麻地上部鮮重；Y為莠去津施用劑量為X時苘麻地上部鮮重占對照干重的比率；C為莠去津使用劑量反應下限；D為莠去津使用劑量反應上限；GR50為苘麻生長抑制中量；b 為斜率。

1.3.2 酶抑制劑NBD-Cl 和馬拉硫磷對莠去津的增效作用 以苘麻敏感種群HB-3 和抗性種群HB-6 為研究對象，測定GSTs 抑制劑4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑（NBD-Cl）和P450s 抑制劑馬拉硫磷對苘麻對莠去津抗性水平的影響。按1.2 所述方法種植苘麻。分別將NBD-Cl（270.00 g·hm-2）用50 μL 氯仿進行溶解，馬拉硫磷（1 000.00 g·hm-2）用50 μL丙酮進行溶解，之后再用0.1%吐溫-80 水溶液定容至20 mL。待抑制劑噴施30 min后再進行莠去津藥劑處理。莠去津的處理劑量為997.50、1 995.00、3 990.00、7 980.00和31 920.00 g·hm-2。每個處理3 個重復，設0.1%吐溫-80 水溶液為對照。處理后21 d 按照1.3.1 的方法計算抑制生長中量GR50及差異倍數（fold change，FC）：

1.3.3 苘麻谷胱甘肽-S-轉移酶（GSTs）和細胞色素P450 氧化酶（P450s）活性測定 選取苘麻敏感種群HB-3 和抗性種群HB-6 進行GSTs、P450s 活性研究，按1.2 所述方法種植苘麻，噴施莠去津田間推薦劑量（1 995.00 g·hm-2）。分別于施藥前和施藥后1、3、5、7、9、14 d 進行取樣，用液氮將樣品迅速冷凍，置于-80 ℃冰箱保存備用。采用ELISA 試劑盒測定解毒代謝酶GSTs和P450s活性。

1.3.4 苘麻psbA基因克隆及序列比對 選取苘麻敏感種群HB-3和抗性種群HB-6，按1.2所述方法種植，待植株生長至4 葉期時，剪取葉片用液氮迅速冷凍，放入-80 ℃冰箱保存備用后，采用DNA 提取試劑盒提取苘麻DNA。參考GenBank 數據庫已報道的苘麻psbA基因序列（NC_053702.1），擴增序列包含已報道的抗性突變位點（表2），將設計好的QM-F1/QM-R1引物送至北京博邁德基因技術有限公司合成，然后采用梯度PCR篩選出引物最佳退火溫度。PCR擴增體系為25 μL：10 μmol·L-1正反引物各0.5 μL、2×Tap PCR MasterMix 12.5 μL、模板3.5 μL、ddH2O 8.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR擴增結束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切取含有目的條帶的凝膠，使用DNA 凝膠回收試劑盒對PCR 產物進行回收。將回收產物與pMD18-T vector 連接，轉化至大腸桿菌TG1 感受態細胞。經過涂板和37 ℃過夜培養，挑取單菌落進行液體振蕩培養4 h，將菌液送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，采用DNAMAN V9.0軟件對敏感和抗性苘麻種群的psbA基因部分序列進行比對分析。

表2 psbA基因擴增引物Table 2 Amplification primers of psbA gene

1.3.5 靶標基因psbA表達量測定 選取苘麻敏感種群HB-3和抗性種群HB-6，按1.2所述方法種植，噴施莠去津田間推薦劑量（1 995.00 g·hm-2）。本研究共包括4 組處理：未經莠去津處理的敏感種群；莠去津處理72 h之后的敏感種群；未經莠去津處理的抗性種群；莠去津處理72 h 之后的抗性種群，每個處理3 次重復。取各處理植株整體，用無菌水沖洗后迅速用液氮冷凍，于-80 ℃冰箱保存備用。RNA 提取參考總RNA 提取試劑盒II R6934 說明書進行。選用Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）將RNA 反轉錄成cDNA，于-20 ℃冰箱保存。將苘麻cDNA按5倍梯度稀釋后作為模板，進行下一步試驗。

本試驗參考GenBank數據庫已報道的苘麻psbA基因序列（NC_053702.1）設計熒光定量引物，以Histone作為內參基因［16］進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）反應（表3），本試驗QM-F2/QM-R2、Histone-F/Histone-R 引物由北京博邁德基因技術有限公司合成。按照Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（High Rox）熒光定量試劑盒說明書配制熒光定量反應體系，采用qRT-PCR儀進行反應。psbA基因PCR擴增體系為10 μL：10 μmol·L-1正反引物各0.5 μL、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix （High Rox）5.0 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 3.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃復性30 s，共40個循環。

表3 psbA基因qRT-PCR擴增引物Table 3 qRT-PCR amplification primers of psbA gene

1.4 數據處理

使用SPSS 19.0 軟件進行數據統計、差異顯著性分析，利用Sigmaplot 14.0軟件繪制劑量-反應曲線，求GR50和FC。

抗性水平分級標準，敏感種群：1≤RI＜2；低抗種群：2≤RI＜5；中抗種群：5≤RI＜10；高抗種群：RI≥10［17］。

采用2-ΔΔCt法計算苘麻psbA基因表達量。

2 結果與分析

2.1 不同地區苘麻種群對莠去津的抗性水平

6 個不同地區苘麻種群施藥后21 d 對莠去津的癥狀反應見圖1。從圖中可以看出，不同地區的苘麻種群對莠去津的反應存在差異。38%莠去津懸浮劑供試劑量為997.50 g·hm-2時，即可明顯抑制種群HB-3 的生長，葉片邊緣開始干枯；其他5個種群正常生長。劑量為1 995.00 g·hm-2時，除種群HB-6植株無明顯受害癥狀以外，其他5 個種群均出現葉片邊緣黃化干枯。施用劑量為3 990.00 g·hm-2時，種群HB-6 僅株高稍有降低，葉片無明顯受害癥狀；其他5個種群植株葉片大部分失綠、干枯，并開始死亡。施用劑量為31 920.00 g·hm-2時，種群HB-6植株葉片枯萎并開始死亡。

圖1 苘麻種群在施用莠去津21 d后的癥狀表現Fig.1 Injury symptoms of A.theophrasti populations 21 days after treatment of atrazine

通過劑量反應曲線可知，在供試劑量范圍內，隨著莠去津處理劑量的增加，不同種群苘麻的生物量降低（圖2）。由表4 可知，不同苘麻種群對莠去津的抗性水平不同，其中抗性種群HB-6 的GR50值最大，為84 721.13 g·hm-2；敏感種群HB-3 的GR50值最小，為1 662.75 g·hm-2，抗性種群較敏感種群的抗性倍數為50.95。

表4 不同苘麻種群對莠去津的劑量反應Table 4 Dose response to atrazine in different populations of A.theophrasti

圖2 不同地理苘麻種群對莠去津劑量-反應曲線Fig.2 Dose-response curves to atrazine in different geographical populations of A.theophrasti

2.2 酶抑制劑NBD-Cl 和馬拉硫磷對莠去津的增效作用

使用GSTs抑制劑NBD-Cl和P450s抑制劑馬拉硫磷處理后，對苘麻生長無明顯影響。抑制劑處理后，敏感種群HB-3對莠去津的敏感性無明顯變化，但提高了抗性種群HB-6 對莠去津的敏感性。用NBD-Cl 抑制劑預處理后，抗性種群HB-6的GR50值由84 721.13 g·hm-2降至7 295.13 g·hm-2，GR50值差異倍數為-11.61。用馬拉硫磷抑制劑預處理后，抗性種群HB-6 的GR50值由84 721.13 g·hm-2降至3 051.29 g·hm-2，GR50值差異倍數為-27.77 （表5）。由上述結果可知，抗性種群HB-6 對莠去津產生抗性與GSTs 和P450s 的解毒代謝有關。

表5 添加酶抑制劑NBD-Cl和馬拉硫磷時苘麻種群對莠去津的抗性水平Table 5 The resistance to atrazine in A.theophrasti with the addition of enzyme inhibitors NBD-Cl and malathion

2.3 莠去津對苘麻谷胱甘肽-S-轉移酶和細胞色素P450氧化酶活性的影響

為了研究苘麻體內GSTs、P450s 對莠去津的解毒代謝能力，采用ELISA 法測定了莠去津處理前后苘麻敏感種群HB-3 和抗性種群HB-6 的GSTs 和P450s 活性變化。

由圖3 可知，莠去津處理后，兩個種群的GSTs 活性都相對于未施藥時有所升高，整體呈現先上升后下降趨勢?？剐苑N群HB-6 的GSTs 活性在1～7 d 內緩慢上升，第7 天時GSTs 活性達到最大值，為0.26 U·g-1，隨著莠去津處理時間的延長，GSTs 活性略有下降。敏感種群HB-3的GSTs 活性在1～5 d 內緩慢上升，第5 天時GSTs 活性達到最大值，為0.24 U·g-1，隨著莠去津處理時間的延長，GSTs 活性逐漸降低。以上結果表明，GSTs 在苘麻對莠去津的解毒代謝過程中發揮了一定的作用，種群HB-6 的GSTs 對莠去津的解毒能力高于種群HB-3，種群HB-6對莠去津產生抗性與GSTs活性增強有關。

圖3 莠去津對苘麻谷胱甘肽-S-轉移酶活性的影響Fig.3 Effect of atrazine on glutathione-S-transferase activity in A.theophrasti

由圖4可知，噴施莠去津后，P450s活性表現為，抗性種群HB-6整體先上升后下降，敏感種群HB-3整體呈先下降后上升。抗性種群HB-6 的P450s 活性在第5 天時達到最大值，為0.24 U·g-1，隨著莠去津處理時間的延長，P450s 活性略有下降，14 d 后P450s 活性上升且高于敏感種群HB-3。敏感種群HB-3 的P450s活性緩慢上升，第5天時最低，隨著處理時間的延長，第9天時P450s 活性達到最大值，為0.20 U·g-1，極顯著高于HB-6，14 d 后P450s 活性逐漸下降。說明抗性種群HB-6 通過提高P450s 活性加快對莠去津的解毒代謝速度，表明苘麻對莠去津的抗性與P450s 解毒代謝作用增強有關。

圖4 莠去津對苘麻P450s活性的影響Fig.4 Effect of atrazine on P450s activity of A.theophrasti

2.4 苘麻psbA基因序列片段比對

利用引物QM-F1/QM-R1 擴增苘麻psbA基因部分保守區域，將擴增序列在NCBI 中進行BLAST 比對，與苘麻psbA基因序列（NC_053702.1）的同源性為99%，擴增片段大小為489 bp，證明擴增產物是包含已報道的抗性突變位點在內的苘麻psbA部分序列。使用DNAMAN軟件比對了敏感種群HB-3和抗性種群HB-6的psbA基因部分序列（圖5），編碼葉綠體D1蛋白264位氨基酸為絲氨酸（Ser），堿基序列未發生突變，也未發現其他氨基酸代替，如Phe255Ile、Asn266Thr或Phe274Val，表明導致種群HB-6 對莠去津產生抗性與靶標基因psbA突變無關。

圖5 苘麻敏/抗種群psbA基因部分序列比對Fig.5 Sequence comparison of mutation loci in A.theophrasti sensitive/resistant populations

2.5 莠去津對苘麻靶標基因psbA表達量的影響

為了研究莠去津對苘麻靶標基因psbA表達量的影響，利用qRT-PCR 技術測定了1 995.00 g·hm-2莠去津苗前處理苘麻后靶標基因psbA在敏感種群HB-3 和抗性種群HB-6 中的表達量（圖6）。結果顯示，未噴施莠去津時，抗性種群HB-6 的psbA初始表達量與敏感種群HB-3的差異顯著；經莠去津處理后，2個種群的psbA表達量均升高，但種群HB-3 的表達量高于種群HB-6，說明苘麻抗性種群HB-6psbA基因表達量與其對莠去津產生抗性無關。

圖6 不同苘麻種群psbA的相對表達量Fig.6 The expression of psbA relative to the Histone in different A.theophrasti populations

3 討論

雜草與農作物有較強的競爭性，嚴重影響農作物的品質和產量。與人工除草相比，除草劑可以高效地清除雜草，具有保障農業高產、穩產等優點，已成為農田雜草防控的主要手段。但是，如長期大量使用單一靶標除草劑，選擇壓力會加快雜草抗藥性的發生速度，影響除草劑的除草效果［18］。我國于20 世紀80 年代中期開始大面積推廣使用莠去津，至今已有約40 年的時間，由于莠去津在我國使用頻率高、劑量大、時間長，導致我國農田雜草對其產生了不同程度的抗性［18］。其中，遼寧省的鴨跖草（Commelina communisL.）對莠去津產生了抗性，其抗性種群較敏感種群對莠去津的抗性倍數高達59.60［17］。本試驗中，河北省內不同地區的苘麻種群對莠去津的敏感性不同，與采集地莠去津用藥史有關；敏感種群HB-3所在采集地未使用過莠去津，GR50值最小，為1 662.75 g·hm-2；種群HB-6 抗性水平最高，使用莠去津年限相對最長，GR50為84 721.13 g·hm-2，抗性指數為50.95。研究結果證實了雜草對莠去津的抗性與其使用時間和選擇壓有關。

在單一除草劑的長期選擇壓力下，大穗看麥娘（Alopecurus myosuroidesHuds.）［19］、麥家公（Lithospermum arvenseL.）［20］、長芒莧［21］等雜草主要通過增強自身解毒代謝酶GSTs 和P450s 的活性，加快對除草劑的解毒代謝能力，保護自身免受除草劑的損害，從而對除草劑產生了非靶標抗性。馬唐（Digitaria sanguinalisL.）［22］、稗草（Echinochloa crusgalli〔L.〕Beauv.）［23］因體內GSTs活性增強而加快了對莠去津的解毒代謝作用，從而對莠去津產生了抗藥性；在我國東北稻區發現，抗性稻稗（Echinochloa oryzicola〔Vasing.〕Vasing）種群P450s 代謝作用增強，導致其對五氟磺草胺產生了抗藥性［24］；鴨跖草對莠去津的抗性是GSTs 和P450s 代謝作用增強和相關基因的表達量升高所致［25］。本研究通過測定敏感和抗性種群GSTs 抑制劑NBD-Cl 和P450s 抑制劑馬拉硫磷對莠去津的增效作用以及GSTs 和P450s活性，發現抗性種群HB-6 對莠去津產生的抗性也與GSTs 及P450s的活性增強有關，進一步印證了GSTs 和P450s 對除草劑的解毒代謝是雜草對除草劑產生非靶標抗性的原因之一。

前人已有研究發現，靶標酶基因突變和過量表達是引起雜草對除草劑產生靶標抗性的主要原因。由于EPSPS基因Pro106Ser突變和EPSPS過表達，導致牛筋草（Eleusine indica〔L.〕Gaertn.）對草甘膦產生抗性［26］；山東省小麥田大穗看麥娘對除草劑啶磺草胺、甲基二磺隆產生抗性是由于ALS基因編碼的Pro197Thr 發生了突變［27］；地膚（Kochia scoparia〔L.〕Schrad.）靶標基因EPSPS和psbA過量表達導致其對除草劑草甘膦和莠去津產生了抗性［28-29］。野蘿卜（Raphanus raphanistrumLinnaeus）由于靶標基因Ser264Gly 突變導致其對賽克津產生抗性［30］。本試驗通過對苘麻敏感種群HB-3 和抗性種群HB-6 的psbA基因部分序列進行擴增和比對，未發現靶標基因psbA發生Ser264Gly 突變；qRTPCR 結果顯示，莠去津處理后，抗性種群HB-6 的psbA表達量反而低于敏感種群HB-3，說明靶標基因psbA表達量變化與抗性種群HB-6 對莠去津的抗性無關。由此推斷，苘麻對莠去津產生的抗性主要是由GSTs和P450s 活性增強引起的非靶標抗性，但是苘麻GSTs 和P450s對莠去津的解毒代謝過程有待進一步研究。

4 結論

本研究通過整株生物測定法，明確了河北省不同地區苘麻種群對莠去津的抗性水平，并對敏/抗苘麻種群進行了GSTs 和P450s 活性差異研究、靶基因psbA突變位點檢測及表達量研究，從非靶標機制和靶標機制兩方面，明確了苘麻對莠去津的抗性是由GSTs 和P450s介導的解毒代謝作用增強引起的。