高能電子束輻照對杜仲葉品質的影響研究

唐藝文 陳 謙 王 鋼 付 孟 黃 敏，* 王 丹 高 鵬

（1西南科技大學，四川 綿陽 621010；2四川省原子能研究院，四川 成都 610101；3輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木。傳統中藥以杜仲樹皮入藥，經學者研究發現杜仲葉和杜仲樹皮具有相似的活性成分［1］，二者均具有補肝益腎、強筋健骨、安胎等功效［2］。杜仲葉是杜仲的干燥葉片，早被《中華人民共和國藥典》（2005版）收載入藥［3］。同時，杜仲葉作為一種藥食同源物質，具有良好的保健功能［4］，其含有的綠原酸具有抗高血壓和降血脂作用［5-7］，蘆丁具有較強的降壓和舒張血管作用［8-9］。作為我國的特有品種，杜仲在我國的種植面積占世界總種植面積的99%以上［10］，主要分布于四川、陜西、湖北等地；同時，在國際市場上，杜仲也是被許多國家認可的中藥材品種，2019年我國杜仲出口量達1 084.6 t，其健康價值倍受國際廣泛好評［10］。

相關數據顯示，種植1畝杜仲的純收入可達3 500元以上［11］，經濟效益良好。同時，原國家林業局發布了相關文件，標志著杜仲產業進入國家整體統籌戰略層面［11］。四川省制定了2025年中藥材產業發展目標：中藥材種植面積達850萬畝、年總產值達300億元以上［12］。杜仲作為川產道地藥材之一［13］，具有良好的發展空間。目前，除了傳統用于藥用成分提取、生產杜仲膠外，作為藥食同源的杜仲在保健食品、飲料等領域也已打開局面［11］。

中藥材在其儲藏過程中易發生腐敗、蟲蛀、霉變等現象［14］，會造成藥材的藥效降低，儲藏時間縮短等不良影響。傳統中藥材的貯藏養護方法存在許多潛在問題與安全隱患，正逐步被市場及政府所規范或淘汰。同時，加強中藥材質量控制、大力推動中藥質量提升是國家關注的重點工作內容［15］。需要新的貯藏養護方法滿足當前需求，因此研發適合中藥材儲藏的新技術是當前研究的熱點內容。

輻照滅菌技術是一種利用放射源產生的γ 射線、加速器產生的高能電子束和X 射線輻照農產品、食品等，達到抑制發芽、推遲成熟、殺蟲滅菌和改進品質等作用的技術［16-17］。相較于傳統的滅菌技術，輻照滅菌是一種綠色、安全、衛生、經濟、高效的“冷殺菌技術”，在食品、農產品的貯藏中已得到廣泛應用［18-23］。《中華人民共和國藥典》將輻照技術作為滅菌的一種處理手段，可用于不受輻射破壞的原料藥及成品等的滅菌［24］。其中高能電子束輻照技術除具有60Co-γ輻照技術相應的優勢外，還具有操作簡便、處理效率高、無放射源衰減、安全性更高等優點，與當前中藥材貯藏養護的需求相切合［25］。

輻照技術在中藥及中藥制品的滅菌和加工上已有相關研究報告，何毅等［26］研究發現，2 kGy 劑量電子束輻照能有效降低麥冬中微生物數量，對其色澤、風味品質、活性成分含量及抗氧化活性無顯著影響；徐光臨等［27］研究發現，黃岑和南星經60Co-γ 射線輻照后滅菌效果理想，且25 kGy 輻照對黃芩和南星有效成分無影響；蔡汶莉［28］研究發現，高能電子束輻照能夠有效殺滅百合和山銀花藥材中的微生物，對藥材品質的影響也較小。可見，輻照技術可在達到滅菌效果的同時，保證藥材藥效。

目前，輻照技術在杜仲葉貯藏加工中的研究較少，梁倩等［29］發現經不同劑量60Co-γ射線輻照后，杜仲等中藥材電子自旋共振（electron paramagnetic resonance，ESR）波譜峰信號強度與吸收劑量均呈二次項關系增長，即輻照產生的自由基含量隨著吸收劑量的增加而增加，但未對其品質進行整體探究。本研究以杜仲葉為研究對象，通過測定不同劑量輻照前后其水分、浸出物、微生物總量、綠原酸含量、蘆丁含量、指紋圖譜相似度來綜合評價電子束輻照對杜仲葉品質的影響，旨在為電子束輻照加工技術在杜仲葉貯藏應用中的質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉，購于四川省中興藥業有限公司；綠原酸對照品（98%）、蘆丁對照品（98%），購于成都埃法生物科技有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基，購于北京奧博星生物技術有限責任公司；甲醇、磷酸等色譜純試劑，購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無水乙醇等分析純試劑，購于成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

UltiMate 3000雙三元、二維液相色譜儀系統，美國賽默飛世爾科技有限公司；RHCX-350超聲波清洗儀，濟寧榮匯超聲波設備有限公司；GE60DA 高壓蒸汽滅菌鍋，美國致微公司；NH300 色差儀，深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照劑量選擇 為確保中藥的安全、有效、質量穩定，根據“中藥輻照滅菌技術指導原則”（2015年第86號）［30］，確定擬采用的最大輻照劑量不超過10 kGy。本試驗設置2、4、6、8 kGy 4 個劑量組和CK（0 kGy）對照組。

1.3.2 藥材處理 杜仲葉采用復合材料真空包裝（20 cm×30 cm，30絲）密封，每袋50 g，每個劑量各3袋，送至重慶恒德輻照技術有限公司采用高能電子加速器（電子束能量10 MeV，功率20 kW）進行輻照處理，輻照劑量設定為2、4、6、8 kGy，以未輻照樣品為對照（CK），經重鉻酸銀劑量計測定樣品的實際吸收劑量分別為2.15、4.05、6.88、8.62 kGy，下文均以設定劑量進行表示。杜仲葉輻照后進行粉碎，過65目篩。

1.3.3 微生物含量測定 測定輻照前后杜仲葉中的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數。參照2020 年版《中華人民共和國藥典》四部通則1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法［24］。

1.3.4 高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）測定活性成分含量和指紋圖譜

1.3.4.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸標品，加入甲醇，配置成濃度為0.22 mg·mL-1的溶液，即得。精密稱取蘆丁標品，加入甲醇，配置成濃度為0.093 mg·mL-1的溶液，即得。

1.3.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取各劑量樣品粉末0.5 g，加入10 mL甲醇，稱重，室溫下超聲提取40 min，取出，冷卻，稱重，用甲醇補足重量，過濾，取濾液，得供試品溶液；各輻照劑量制備3個平行。

1.3.4.3 色譜條件 色譜柱：Hyersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：以0.1%磷酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL。綠原酸的檢測波長為327 nm，蘆丁的檢測波長為208 nm，指紋圖譜檢測波長208 nm。

表1 流動相時間程序Table 1 The time program of mobile phase

1.3.4.4 含量測定 設置待測液進樣量10 μL 進行液相色譜儀測定，并采用外標法計算樣品中綠原酸與蘆丁的含量。

1.3.4.5 指紋圖譜采集 按上述方法制備對照品和供試品溶液，設置進樣量10 μL、檢測波長208 nm 進行測定，得到杜仲葉的HPLC指紋圖譜。

1.3.5 色澤測定 參照呂緒楨等［31］的方法，通過色差儀測定杜仲葉樣品的色澤，記錄亮度值L*值、紅綠值a*值、黃藍值b*值，按照公式計算飽和度C和總色差ΔE：

1.3.6 水分、浸出物含量測定 杜仲葉水分和浸出物含量參照2020 版《中華人民共和國藥典》中的方法進行測定［24］。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0 軟件對3 次重復試驗所得數據進行顯著性分析和相關性分析；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版進行HPLC指紋圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照對杜仲葉藥材微生物數量的影響

根據2020年版《中華人民共和國藥典》規定［24］：非無菌藥用原料及輔料的微生物限度標準為需氧菌總數不超過103CFU·g-1，霉菌和酵母菌總數不超過102CFU·g-1，對控制菌未做統一規定。由微生物測定結果（表2）可知，未經輻照的杜仲葉樣品中微生物數量大于限量標準，不符合藥典要求。當電子束輻照劑量達到2 kGy時，杜仲葉的微生物數量下降至藥典中所規定的非無菌藥用原料及輔料的微生物限量標準，并且輻照劑量越大，杜仲葉中微生物數量越少，當輻照劑量為4 kGy時，微生物數量均降低至檢測限（10 CFU·g-1）以下。

表2 電子束輻照處理對杜仲葉微生物總數的影響Table 2 Effect of electron-beam irradiation on the microbial loads of Eucommia ulmoides leaves

2.2 電子束輻照對杜仲葉藥材中活性物質含量的影響

綠原酸和蘆丁是杜仲葉主要活性成分，其含量是評價杜仲葉品質的重要指標。由表3 可知，輻照前后杜仲葉中綠原酸含量在0.21%～0.28%之間，均大于0.080%，符合2020年版《中華人民共和國藥典》要求［24］。輻照前后杜仲葉中蘆丁含量在0.07%～0.09%之間，波動較小。與CK 相比，2、4、6 kGy 劑量電子束輻照處理后樣品中綠原酸和蘆丁含量顯著增加（P＜0.05），但變幅較小；當輻照劑量為8 kGy 時，二者與CK 相比差異不顯著（P＞0.05）。相關性分析發現（表4），綠原酸、蘆丁含量與輻照劑量之間呈負相關，但相關性不顯著（P＞0.01）。

表3 電子束輻照對杜仲葉綠原酸、蘆丁的影響Table 3 Effect of electron-beam irradiation on the chlorogenic acid content and rutin content of Eucommia ulmoides leaves

表4 輻照劑量、綠原酸及蘆丁含量間的相關性Table 4 Corrlation analysis among absorbed dose，chlorogenic acid and rutin content

2.3 電子束輻照對杜仲葉指紋圖譜的影響

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）對不同輻照劑量電子束輻照處理杜仲葉的HPLC 圖譜進行數據分析，以未輻照（CK）杜仲葉作為參照圖譜，進行多點校正、自動匹配（時間窗寬度為0.01），標定16 個共有峰作為杜仲葉的特征峰，生成對照圖譜R，見圖1。其中7號峰為綠原酸，11號峰為蘆丁。將經不同輻照劑量電子束輻照處理杜仲葉的指紋圖譜與對照圖譜進行比較，計算得到與對照指紋圖譜的相似度，結果見表5。以7 號峰綠原酸為參比峰（設定其相對保留時間和相對峰面積為1），計算其余各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表6、表7。結果表明，不同劑量電子束輻照處理的杜仲葉指紋圖譜相似度范圍為0.979～0.998，杜仲葉各共有峰相對保留時間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）范 圍 為0.09%～0.40%，相對峰面積的RSD 范圍為4.57%～26.82%，表明在2～8 kGy 輻照劑量范圍內，杜仲葉中的成分仍保持較好的一致性。

圖1 杜仲葉的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms and reference of Eucommia ulmoides leaves

表5 不同輻照劑量電子束輻照處理杜仲葉的HPLC相似度Table 5 HPLC chromatograms similarity evaluation of Eucommia ulmoides leaves irradiated by different absorbed doses of electron-beam

表6 杜仲葉HPLC指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間Table 6 Characteristic peak relative retention time of Eucommia ulmoides leaves

表7 杜仲葉的HPLC指紋圖譜中各共有峰的相對保留面積Table 7 Characteristic peak relative retention area of Eucommia ulmoides leaves

2.4 電子束輻照對杜仲葉色澤的影響

色澤是反映中藥材品質的重要指標之一。輻照前后各劑量下的L*值、a*值、b*值、C值和ΔE值見表8，各指標間相關性結果見表9。結果表明，與CK 相比，經2、4 kGy 輻照后，杜仲葉的L*值顯著增加（P＜0.05），但總體數值變化幅度較小，6、8 kGy輻照劑量下的L*值無顯著變化（P＞0.05）。相關性分析發現，L*值與所選輻照劑量（2～8 kGy）之間無顯著相關性（P＞0.05）。

表8 電子束輻照對杜仲葉色澤的影響Table 8 Effect of electron-beam irradiation on Hunter’s color of Eucommia ulmoides leaves

表9 輻照劑量與色澤的相關性Table 9 Corrlation analysis among absorbed dose and Hunter’s color

a*值表示紅綠值，經測定均為正值，即杜仲葉主要呈現為紅色。與CK相比，經2 kGy劑量輻照時，a*值無顯著變化（P＞0.05），經4 kGy 劑量輻照時顯著降低（P＜0.05），達到最低值。低劑量輻照下（輻照劑量小于5 kGy），隨著輻照劑量的增加，a*值減小。與CK相比，經6、8 kGy輻照后，a*值顯著升高（P＜0.05）。a*值與輻照劑量之間呈顯著正相關（P＜0.01）。

b*值表示黃藍值，測定結果顯示杜仲葉略微偏黃。各劑量輻照后均呈現顯著變化（P＜0.05）。低劑量輻照時（輻照劑量小于5 kGy），隨著輻照劑量的增加，b*值減小，4 kGy 時最低。與CK 相比，經6、8 kGy 劑量輻照后，b*值顯著升高（P＜0.05）。b*值與輻照劑量之間無顯著相關性（P＞0.01）。

C值表示色彩飽和度，與CK 相比，經2 kGy劑量輻照時無顯著變化（P＞0.05）；4、6、8 kGy 劑量輻照下，C值發生顯著變化（P＜0.05），并且在4 kGy時C值最低。

ΔE值為總色差，表示經不同劑量電子束輻照處理后杜仲葉顏色變化，越大表示與對照組杜仲葉顏色差異越明顯。經各劑量輻照后，測得ΔE值的范圍為1.14～1.91，各劑量下的ΔE值均無顯著差異（P＞0.05），且與輻照劑量之間無顯著相關性（P＞0.01）。當輻照劑量為2 kGy時，ΔE為1.14，與CK差異最小，即2 kGy輻照劑量對杜仲葉的色澤影響最小。

2.5 電子束輻照對杜仲葉理化性質的影響

電子束輻照后杜仲葉中水分、浸出物含量的測定結果見表10。輻照前后杜仲葉中水分含量范圍為7.02%～10.16%，水分含量最高的是CK，達10.16%，隨著輻照劑量的增加，杜仲葉中水分含量呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），輻照劑量為8 kGy 時，水分含量為7.02%，與CK 相比下降了3.14 個百分點。由表11可知，杜仲葉水分含量與輻照劑量呈顯著負相關（P＜0.01）。

表10 電子束輻照對杜仲葉水分、浸出物含量的影響Table 10 Effect of electron-beam irradiation on moisture and extracts content of Eucommia ulmoides leaves /%

表11 輻照劑量與杜仲葉水分、浸出物含量的相關性Table 11 Corrlation analysis among absorbed dose，moisture and extracts content

醇溶性浸出物含量范圍為30.17%～34.83%。CK組醇溶性浸出物含量為30.92%，當輻照劑量為2 kGy時，醇溶性浸出物含量與CK 相比無顯著差異（P＞0.05）。隨著輻照劑量的增大，醇溶性浸出物含量呈現先增加再減少趨勢，在輻照劑量為4 kGy 時，測得浸出物含量達到最高峰值34.83%，8 kGy 時達到最低值30.17%。由表11 可知，醇溶性浸出物含量與所選輻照劑量（2～8 kGy）之間無顯著相關性（P＞0.01）。

3 討論

3.1 電子束輻照對杜仲葉微生物數量的影響

微生物是影響杜仲葉貯藏期的重要因素，高能電子束具有較高能量的電子束，能夠誘導活細胞中細胞基因組、生理生化和形態發生改變，從而控制杜仲葉中的微生物數量［32］。本研究表明，電子束輻照能顯著降低杜仲葉藥材中的微生物數量，在輻照劑量為2 kGy時，杜仲葉中的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數均降低至《中華人民共和國藥典》中規定的微生物限量標準以下［24］，并且隨著電子束輻照劑量的增加，對杜仲葉中微生物的抑制作用增強。何毅等［26］研究發現，2 kGy 電子束輻照可有效降低麥冬中微生物數量至藥典規定的微生物限度標準以下，與本研究結果一致。表明采用電子束輻照可有效控制中藥材中的微生物數量，符合藥典中對中藥材中微生物含量的相關規定。

3.2 電子束輻照對杜仲葉活性成分含量的影響

綠原酸和蘆丁是杜仲葉中的兩種主要活性成分，其含量是評價杜仲葉品質的重要因素，其中綠原酸具有清除自由基、抗菌消炎、抑制腫瘤等生物活性［33］；蘆丁作為一種黃酮醇，具有抗炎、抗氧化、保護血管等作用［34］。2020年版《中華人民共和國藥典》規定杜仲葉中綠原酸含量不得低于0.080%［24］。本研究發現，各輻照劑量下測得的綠原酸含量均達到藥典要求，并且與對照組相比，各輻照劑量下杜仲葉中綠原酸、蘆丁含量的變化不大，表明當輻照劑量為2～8 kGy時，杜仲葉中的綠原酸、蘆丁含量仍較為穩定，這與徐遠芳等［23］對葛根粉、范偉［35］對連翹的研究結論較為一致。

3.3 電子束輻照對杜仲葉HPLC指紋圖譜的影響

指紋圖譜作為中藥質量控制的常用方法，可整體評價中藥材成分的穩定性。在中藥材輻照滅菌方面，指紋圖譜已得到一定的應用，如大黃粉［36］、山銀花［37］、連翹［35］、山藥［38］等。本研究結果顯示，經不同輻照劑量電子束輻照前后的杜仲葉指紋圖譜相似度均大于0.90，可見不同輻照劑量電子束輻照處理杜仲葉的圖譜整體較為一致，這與徐遠芳等［37］、王強等［39］的研究結果一致。其中，相對峰面積的RSD 在4.57%～26.82%之間，上述結果表明，表明電子束輻照對杜仲葉某些成分的含量產生了不同程度的影響，造成部分化學成分含量的升高或降低，這與張曉彬等［40］對川芎的研究結果較為一致。上述結果表明，與對照相比，經不同輻照劑量的電子束輻照處理后杜仲葉的指紋圖譜整體仍較為一致且穩定。

3.4 電子束輻照對杜仲葉理化性質及色澤的影響

水分含量是評價杜仲葉品質的質量指標之一，與藥材貯藏時發生的蟲蛀與霉變有密切關系［41］。本研究發現，輻照前后杜仲葉中的水分含量均能達到藥典中的規定，隨著輻照劑量的增加，杜仲葉中的水分含量呈現顯著下降趨勢。Gani等［42］用γ射線對蕓豆淀粉進行輻照后發現其水分含量顯著下降，其中紅色蕓豆的水分含量經10 kGy劑量輻照后下降約44.4%，與本研究結果基本一致。杜仲葉的水分含量隨輻照劑量的增加呈顯著降低的趨勢，原因可能是電子束在穿透樣品的過程中會產生一定的能量損耗，導致水分流失［42］；或是電子束輻照造成纖維素結構的破壞［43］，而植物纖維有很強的吸水特性［44］，結構被破壞后可能導致其對水分的吸附作用降低，造成水分減少。輻照前后杜仲葉中的醇溶性浸出物含量均能達到藥典中的規定，在一定范圍內，隨著輻照劑量的增加，浸出物含量增大，與何毅等［26］對黃精的研究結果一致，但用較高劑量輻照時，可能對物質成分產生一定的破壞作用，導致含量降低。

4 結論

本研究結果顯示，2 kGy及以上的輻照劑量能有效降低杜仲葉中微生物數量至可接受范圍，即2 kGy 為杜仲葉的最低有效輻照劑量。綜合評價輻照前后水分、浸出物、色澤及活性成分的變化情況，2 kGy的輻照劑量能保證杜仲葉的微生物數量有效降低，同時對其品質的影響最小。通過比較指紋圖譜發現輻照前后杜仲葉整體成分較為穩定。綜上，電子束輻照技術是一種能有效控制杜仲葉微生物數量的方法，且在一定的輻照劑量范圍內對杜仲葉質量無明顯影響。