基于數據挖掘及網絡藥理學探討治療系統性紅斑狼瘡經驗

張開源，何詩雅，陳麗瑩，姚心怡，王新昌

1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院風濕免疫科，浙江杭州 310005

系統性紅斑狼瘡（systemic lupuseryth ematosus，SLE）是一種以多器官、多系統損害，體內有多種自身抗體為特征的自身免疫性疾病，其主要好發于年輕育齡期婦女，男女比例可高達1:9。SLE 目前還沒有根治的辦法，西藥治療以抗瘧藥、糖皮質激素、免疫抑制劑及生物制劑為主，且常會出現各種不良反應[1]。臨床實踐已證實中醫藥治療SLE 可以減少西藥產生的不良反應，調節全身機能，有效提高患者的生活質量，具有增效減毒的作用[2]。本研究收集整理浙江中醫藥大學附屬第二醫院王新昌教授治療SLE 的中醫醫案，借助數據挖掘和網絡藥理學對其用藥規律和核心藥對進行分析，以期為中醫藥治療SLE 提供新的臨床依據和思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

整理浙江中醫藥大學附屬第二醫院門診病歷系統中自2018 年2 月至2022 年1 月王新昌教授治療SLE 的處方數據。①符合2009 年系統性紅斑狼瘡國際協作組（systemic lupus interna-tional collaboration clinics，SCLICC）制訂的SLE 分類標準；②符合1994年國家中醫藥管理局《中醫病證診斷療效標準》紅蝴蝶瘡相關標準；③以服用中藥湯劑為主要方法治療SLE 的患者。排除標準：①不符合上述中西醫診斷標準者；②以外用中藥、西藥治療為主的病例。

1.2 方法

將檢索信息錄入并整理至Excel 表格，采取雙人雙機獨立操作。中藥名稱規范標準參照《中國藥典2020 年版》[3]為準。如將“丹皮”規范為“牡丹皮”，“浙石斛”規范為“石斛”等。①運用Excel軟件進行頻數分析，統計所有使用中藥的頻次、所屬類別、四氣、五味、歸經等的頻數與頻率；②運用IBM SPSS Modeler 軟件對中藥進行關聯分析，使用Apriori 算法，最小支持度設置為10%，最小置信度設置為80%。基于網絡藥理學的核心藥對作用機制分析：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）、既往文獻搜索生地黃、牡丹皮、赤芍的化學成分，以口服生物利用度≥30%和藥物相似性≥0.18 作為篩選條件，篩選出活性成分較高的化合物。應用UniProt（http://www.uniprot.org）知識庫整合蛋白靶點轉化為基因標志。在GeneCards（https://www.genecards.org）數據庫和OMIM（http://omim.org）數據庫中檢索“Systemiclupuserythematosus”，從而得到SLE 相關疾病靶點。利用Venn（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn）在線軟件將三味藥物與疾病的靶點取交集。將篩選得到的藥物-疾病共同靶蛋白上傳至STRING（https://string-db.org）在線平臺數據庫，應用Cytoscape3.7.2 構建蛋白相互作用網絡圖。使用Cytoscape 構建“中藥-化合物-靶標”網絡圖并利用CytoHubba 計算出前4 位SLE 關鍵療效基因。

2 結果

2.1 SLE 處方數據挖掘

2.1.1 用藥頻次與歸經 對納入的醫案首診方進行統計，共計116 首，涉及中藥共176 種，累計頻次共1691 次。其中使用頻次≥30 的藥物共有14 味。高頻藥物前五位依次為牡丹皮、赤芍、生地黃、白術、青蒿。對納入處方中的中藥進行歸經統計，歸經以肝經為最，其次為肺經、脾經。

2.1.2 常用中藥類別統計 對納入處方中的中藥進行類別統計，排列得出SLE 常用中藥類別：所用中藥共18 類，其中藥味數≥10 味的依次為補虛藥（31味，17.61%）、清熱藥（29 味，16.48%）、解表藥（15味，8.52%）、活血化瘀藥（14 味7.95%）、利水滲濕藥（13 味，7.39%）、理氣藥（10 味，5.68%）、祛風濕藥（10 味，5.68%）。

2.1.3 常用藥物組合關聯分析 對處方中的中藥進行關聯分析，以支持度排序，排名前3 位的藥對為赤芍-牡丹皮、生地黃-牡丹皮、生地黃-赤芍，由此可以得出生地黃-牡丹皮-赤芍為王新昌教授治療SLE 的核心藥對，見表1。

表1 常用藥物組合統計

2.2 核心藥對作用機制

2.2.1 “生地黃-牡丹皮-赤芍”與SLE 的交集靶點 通過數據庫得到“生地黃-牡丹皮-赤芍”共同藥物作用靶點406 個，從數據庫獲得SLE 疾病靶點1129 個，通過Venn 圖交集獲得115 個“藥物-疾病”共同作用靶點。

2.2.2 “生地黃-牡丹皮-赤芍”蛋白互作網絡 利用STRING 和Cytoscape 構建PPI 網絡，并進行hub 基因分析發現STAT3、MAPK1、AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CXCL8、IL-6 等可能是核心藥對治療SLE的關鍵療效靶點。

2.2.3 “中藥-化合物-靶標”網絡和關鍵療效靶點鑒定 利用Cytoscape 構建的“中藥-化合物-靶標”網絡圖發現網絡節點176 個，相互作用關系445 條。其中來自生地黃的化合物有48 個；來自牡丹皮的化合物有2 個；來自赤芍的化合物有7 個；該藥物組合有一個共同化合成分為（+）-兒茶素。使用CytoHubba 插件的Degree 算法鑒定出hub 基因：STAT3（Degree=36）、MAPK1（Degree=29）、AKT1（Degree=28）和IL-6（Degree=22）。

3 討論

3.1 SLE 病因病機與處方規律

中醫古籍中并無“系統性紅斑狼瘡”這一病名的記載。依據其紅斑、發熱與損及關節、內臟時的表現，可歸屬于中醫“陰陽毒”“紅蝴蝶瘡”“痹病”、“腎臟風毒”等范疇[4]。李衛國[5]認為肝腎虧虛為本病的發病基礎，熱毒內伏營血是本病的病機關鍵，致病因素有風寒濕熱瘀毒之別。尹維賢[6]認為SLE以肝腎陰虛為本，以熱毒、瘀血、痰濁等為標，為本虛標實之證。王新昌教授認為SLE 以陰虛為本，熱毒、瘀血、痰濕為標，本虛標實，互為因果。隨著疾病的發展亦能出現阻滯氣機、化火生風、耗傷氣血、陰損及陽等不同的轉歸和預后，因此，臨床上證型復雜多樣，常寒熱錯雜，虛實夾雜。治療上標本并治，以滋陰清熱、涼血活血、健脾益氣、利水化濕者為多，兼以理氣、散風、解表、溫陽。藥物上寒溫并用，多以甘緩補虛、苦燥泄熱、辛散溫通，以歸肝經為多，兼顧肺、脾、腎、胃。藥力常達于血分。SLE 患者中多為育齡期女性，且臨床上SLE 常見弦脈。結合SLE 患者的生理病理特點和臨床經驗，認為女子屬陰且陰虧者多見，而育齡期女子肝正當主時令，故將育齡期女性生機勃勃的特點與春季萬物生發的特性相類比，提出“關鍵病位在肝”的見解。從衛氣營血角度看，SLE 多為血分病變，肝屬血分，以上論述均強調了肝的重要地位。通過對SLE 病機的充分認知及對病情的精準把控辨證用藥，使藥力常達于血分，具有良好的臨床療效，并提出了“關鍵病位在肝，以調肝復圓為要”的新見解。

3.2 核心藥對初步分析

牡丹皮、生地黃為溫病經典藥對。《溫病條辨》[7]記載太陰伏暑，舌赤口渴，無汗者，為邪在血分而表實，用銀翹散加生地、丹皮、赤芍、麥冬。《濕熱論》[8]治濕熱證，上下失血，或汗血，毒邪中入營分，走竄欲泄，用大劑量犀角、生地、丹皮、赤芍等。三者功效相近，常相須為用共奏清熱涼血之功。一項基于329 例中醫藥治療的數據挖掘結果表明，熱毒、血瘀、陰虛是的基本病因病機，清熱藥、補虛藥、活血化瘀藥位居治療藥物前3 位，這類藥物可能作用于腺苷酸活化蛋白激酶、酶磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 等信號通路，其中包括“生地黃-牡丹皮-赤芍”的藥物組合[9]。一項關于合并皮膚損害的276 例處方用藥規律分析表明，生地黃、牡丹皮、赤芍是治療皮膚損害的主要藥物，其主要通過環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號、鈣信號等通路發揮關鍵作用[10]，由此可知，生地黃-牡丹皮-赤芍藥對始終貫穿疾病治療的全過程，三藥合治狼瘡有相得益彰之功。

3.3 核心藥對機制探討

生地黃是臨證中治療頻次最高的藥物之一。通過中藥治療含生地黃處方用藥規律分析后發現，其多用生地黃為主的滋補肝腎陰津之法扶正，清熱涼血解毒之法祛邪，兼以活血化瘀之品[11]。現代藥理學研究表明，生地黃表現出顯著的抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等多重功效。以生地黃為君藥的復方生地合劑，被用于陰虛內熱證患者的治療，其能夠抑制TLR-MyD88-NF-κB 信號傳導，從而改善MRL/Lpr 系統性紅斑狼瘡小鼠Th17/Treg 細胞失衡[12]。槲皮素與山柰酚均是中藥牡丹皮的主要療效靶點。兩者均具有抗炎、抗氧化、調節免疫、抗氧化應激等功能。

（+）-兒茶素是該核心藥物中共同治療的潛在活性成分，兒茶素通過調節胸腺T 淋巴細胞增殖及細胞介質水平，恢復T 細胞亞群的平衡從而發揮免疫細胞的正常功能，具有抗炎、調節免疫等作用。之后進一步通過網絡藥理學的方法對核心藥對治療的起效機制進行探討與分析，構建了蛋白質互作網絡后鑒定出以下四種樞紐靶點：①信號傳導及轉錄激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）：STAT3 是一種能夠介導細胞對白細胞介素等生長因子反應的信號轉導器和轉錄激活因子。STAT 上游的Janus 激酶（activation of janus kinases，JAK）是一類胞內非受體酪氨酸激酶家族，JAK 與其受體的結合導致受體細胞質部分的構象改變，啟動與受體相關JAK 的激活。隨后，JAKs介導特定受體酪氨酸殘基的磷酸化，使之成為二聚體，從而進入核轉錄[13]。JAK-STAT 信號通路幾乎介導了所有免疫調節過程，異常的JAK-STAT 信號被認為與免疫紊亂、炎癥狀態和自身免疫性疾病有關[14]。STAT3 磷酸化可以介導干擾素α 對SLE 中的B 細胞起到分化和活化的作用，表明STAT3 對SLE 的疾病進展起到了關鍵作用[15]。②白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）：IL-6 是急性期反應的有效誘導劑，其主要作用于B 細胞、T 細胞、肝細胞、造血祖細胞和中樞神經系統細胞，主要參與淋巴細胞和單核細胞的分化，尤其在B 細胞向Ig-分泌細胞的最終分化中起重要作用。SLE 患者中IL-6 的表達水平顯著升高，且IL-6 的表達水平與C 反應蛋白顯著相關[16]。③絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（serine/threonineprotein kinase B，AKT1）：AKT1 它能夠調節細胞增殖和血管生成等許多過程。磷脂酰肌醇3（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）活化后能夠激活AKT 信號，轉導AKT 激酶從而調控SLE 的發病過程。AKT1 是PI3K信號通路的關鍵下游靶點，且在外周血B 細胞和T細胞的分化中起細胞內穩態的作用[17]。B 細胞穩態紊亂與SLE 密切相關。PI3K-AKT 和JAK-STAT 通路的過度激活可能導致SLE 中趨化因子受體4 的失調，而趨化因子受體4 水平失調在SLEB 細胞中與疾病活動度和腎臟受累程度相關[18]。一項網絡藥理學研究也驗證了PI3K-AKT 與“生地黃-牡丹皮-赤芍”藥對的相關性[9]。④絲裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）：MAPK1 和MAPK3 是級聯中發揮重要作用的兩個MAPKs。根據細胞環境的不同，MAPK 級聯反應通過調節轉錄、翻譯、細胞骨架重排從而影響細胞生長、黏附、存活和分化等多種生物學功能。有研究證明，SLE 外周血單個核細胞的MAPK1 的表達水平與輔助性T 細胞1、調節性T 細胞和白細胞介素10 的表達水平顯著相關[16]。且有研究結果表明，“生地黃-牡丹皮-赤芍”藥對治療SLE 的機制可能是通過MAPK 信號通路[9]。

本研究利用數據挖掘技術將臨床上模糊、繁雜、不規范的臨床醫案進行規范化、標準化處理，總結SLE 臨床用藥規律，對核心藥對生地黃-牡丹皮-赤芍治療SLE 的化學成分、關鍵靶點和作用通路進行研究。生地黃-牡丹皮-赤芍三藥合治狼瘡有相得益彰之功，但其影響SLE 疾病發生、發展的作用機制仍有待進一步的臨床、細胞與動物實驗驗證。