吸入糖皮質激素對毛細支氣管炎患兒血miR-302e、NF-κB RNA 表達的治療觀察

陳福將，吳超雄，蔡振蕩，何麗丹

溫州市中西醫結合醫院兒科，浙江溫州 325000

毛細支氣管炎是嬰幼兒最常見的下呼吸道感染。NF-κB 是一種二聚體轉錄因子,參與炎癥、宿主免疫反應、細胞黏附、生長信號、細胞增殖、細胞分化和細胞凋亡[1]。近來的研究報道，NF-κB 通路在RSV 感染小鼠的氣道炎癥中具有關鍵作用[2]。研究顯示，腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-8（interleukin-1，IL-8）和白?細胞介素-6（interleukin-1，IL-6）等細胞因子可以誘導NF-κB 過表達[3]；NF-κB 家族成員的RelA（p65）可以調節多個下游靶基因的轉錄活性[4]。研究證明，?miRNA 參與誘導肺內炎癥，其與肺內炎癥之間的關系及其作用值得進一步研究。目前為止，有關miRNA 在毛細支氣管炎中的作用的研究報道不多。研究顯示，在肺炎小鼠模型中，miR-302e 的表達降低，miR-302e 的過表達可減少炎癥并抑制RelA，BRD4 和NF-κB 的蛋白表達[5]。本研究旨在觀察吸入糖皮質激素對毛細支氣管炎患兒 miR-302e、NF-κB RNA 表達的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

毛細支氣管炎組：選取2021 年1 至9 月溫州市中西醫結合醫院的毛細支氣管炎住院患兒 60例，均為首次發病，無基礎心肺疾病、無免疫抑制及免疫缺陷疾病；60 例患兒采用隨機數字表法隨機分成激素組和非激素組，非激素組常規予可必特、沐舒坦霧化吸入，氣道阻塞嚴重者給予吸痰和氧療；激素組入院后即加用普米克令舒（布地奈德懸浮液）霧化吸入，>2 歲1.0mg，<1 歲0.5mg，2次/d，連用5d。參考Bearman 等[6]提出的標準，根據入院臨床癥狀（呼吸次數、哮鳴音、發紺情況、輔助呼吸機參與）評分分為輕度組、中重度組。對照組：收集同期本院保健門診體檢健康兒31 例，無個人和家族特應癥（如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎等）病史。本研究通過溫州市中西醫結合醫院倫理委員會的審查批準（倫理審批號：2021-L-040），并得到患兒監護人的知情同意。

1.2 方法

①血清標本采集：各組患兒于入院后次晨抽取空腹靜脈血2ml，毛細支氣管炎組在入院后第5 天再次抽取恢復期靜脈血2ml，室溫（20～25℃）放置60min，2000 轉/分離心10min，留取血清-70℃凍存備測。② RT-PCR 檢測：全血檢測miR-302e、NF-κB（p65）RNA 的表達水平，各組患兒于入院后次晨另取空腹靜脈全血2ml，毛細支氣管炎組在入院后第5天再次抽取恢復期靜脈血2ml，-70℃凍存備測。首先按照Trizol 試劑說明書提取總RNA，去除基因組DNA，加入引物酶RT 酶混合物I、RT 引物混合物、M-MuLV 反向轉錄酶反轉錄為cDNA；然后PCR 擴增，PCR 反應體系：2×SYBR 綠色qPCR 主混合物，正向引物、反向引物、cDNA、RNase 游離水。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上點樣，電泳25min 后，用SmartView 凝膠數字成像系統掃描分析擴增產物條帶，分別測定各擴增帶灰度值，以各目的基因擴增帶灰度值比內參照GAPDH 擴增帶灰度值，作為其RNA 水平的指標。主要試劑來源：RT-PCR 試劑盒由Servicebio 公司提供，瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑由北京索萊寶科技有限公司提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。應用2-△△Ct方法計算miR-302e、NF-κB（p65）RNA 相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 10.0 統計學軟件對數據進行分析處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，正態分布的兩組樣本均數比較采用t檢驗，方差不齊者用t’檢驗,多組樣本均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者用DunnettT3檢驗，兩兩比較采用q檢驗。兩變量相關分析采用Bivariate 過程的Pearson等級相關法，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

毛細支氣管炎患兒激素組與非激素組患兒的年齡、體質量、入院前病程及住院天數比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。對照組31 例，男15例，女16 例，平均（8.64±2.62）月齡，各組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 毛細支氣管炎患兒激素組與非激素組臨床資料比較（± s）

表1 毛細支氣管炎患兒激素組與非激素組臨床資料比較（± s）

2.2 急性期毛細支氣管炎組與對照組血miR-302e、NF-κB（p65）RNA 表達水平比較

熒光定量RT-PCR 檢測結果顯示急性期毛細支氣管炎激素組、非激素組患兒血miR-302e 的表達水平均顯著低于對照組，NF-κB（p65）RNA 的表達水平均顯著高于對照組，用2-△△Ct方法計算RNA 相對表達量，見表2。

表2 急性期各組血miR-302e、NF-κB RNA 表達比較（± s，pg/ml）

表2 急性期各組血miR-302e、NF-κB RNA 表達比較（± s，pg/ml）

注：與對照組比較，*P<0.01

2.3 恢復期毛細支氣管炎組血miR-302e、NF-κB RNA 表達水平比較

熒光定量RT-PCR 檢測結果顯示：恢復期毛細支氣管炎激素組患兒血miR-302e 的表達水平顯著高于非激素組，而NF-κB（p65）RNA 的表達水平顯著低于非激素組，應用2-△△Ct方法計算RNA 相對表達量，見表3。

表3 恢復期毛細支氣管炎組血miR-302e、NF-κB RNA表達比較（± s，pg/ml）

表3 恢復期毛細支氣管炎組血miR-302e、NF-κB RNA表達比較（± s，pg/ml）

2.4 相關性分析

兩變量Pearson 等級相關法分析結果顯示毛細支氣管炎患兒血miR-302e 的表達水平與NF-κB（p65）RNA 的表達水平呈顯著負相關（r=-0.727，P<0.01）；毛細支氣管炎患兒血miR-302e、NF-κB（p65）RNA的表達水平與病情嚴重程度密切相關，其中miR-302e 的表達水平與入院臨床癥狀評分呈負相關（r=-0.845，P<0.01），而NF-κB（p65）RNA 的表達水平與入院病情評分呈正相關（r=0.694，P<0.01）。

3 討論

研究顯示，支氣管炎的氣道具有NF-κB 家族（RelA 和NF-κB2）的上調,且具有較高水平的NF-κB誘導的TH2型細胞因子（白細胞介素10、13）[4]。最近的研究發現，RSV 感染毛細支氣管炎小鼠存在RelA（p65）的高表達，抑制NF-κB/IL-33/ST2 軸可以減輕RSV 感染引起的急性細支氣管炎[7]。Mishra等[8]認為NF-κB 調節許多促炎介質、黏附分子、呼吸道黏蛋白及生長和血管生成因子的表達，NF-κB通路激活在哮喘發病機制中發揮主要作用。

本研究結果表明，急性期毛細支氣管炎激素和非激素組NF-κB（p65）RNA 的表達水平均顯著高于健康對照組，與RSV 感染的毛細支氣管炎小鼠NF-κB（p65）RNA 的高表達研究結果相一致[7]。另外本研究相關分析表明，毛細支氣管炎組血NF-κB（p65）RNA 的表達水平與入院時評分呈正相關，表明毛細支氣管炎患兒血NF-κB（p65）RNA 的表達水平與病情嚴重程度密切相關。

miRNA 在調節基因表達中起關鍵作用，在呼吸道病毒誘發的免疫反應中發揮重要作用，已引起越來越多的關注[10-11]。研究表明，哮喘小鼠肺組織中檢測到多種miRNA 顯著差異性改變，這些miRNA參與調節哮喘的氣道炎癥、轉化生長因子β 信號轉導以及包括凋亡和炎癥在內一些信號通路[12]。Mi-RNA 是哮喘診斷和嚴重程度評估的有前途的工具[13]。有關miRNA 在毛細支氣管炎中的研究報道不多，研究顯示，miR-26b 在毛細支氣管炎患兒血淋巴細胞中存在差異表達，可能參與了炎癥的發生[14]。最近的研究發現，RSV 感染降低了氣道上皮細胞中miR-34b/miR-34c 的表達，從而導致RSV 疾病中的黏液過度分泌[15]。Zhang 等[16]在嚴重RSV 相關肺炎的研究發現，顯著上調的miRNA 有miR-1271-5p、miR-10a-3p 等，可能反映嚴重的RSV 相關性肺炎，這些miRNA 靶基因參與了NF-κB 信號通路。Xiao等[17]研究顯示，miR-302e 通過抑制NF-κB 活化來抑制過敏性炎癥，表明miR-302e 可能在過敏性疾病中發揮抗炎作用，并作為治療過敏性疾病的新治療靶點發揮作用。本研究結果顯示，毛細支氣管炎激素組、非激素組患兒血miR-302e 的表達水平均顯著低于健康對照組，相關分析結果表明毛細支氣管炎患兒血miR-302e 的表達水平與入院時評分呈負相關，表明毛細支氣管炎患兒血miR-302e 的低表達與毛細支氣管炎的病情密切相關，能反映毛細支氣管炎的氣道炎癥程度。

研究發現，糖皮質激素在炎癥過程中可以通過糖皮質激素受體介導調節miRNA 的表達，如參與炎癥反應的miR-98、miR-155 和miR-511[18]。在感染性休克的研究發現，地塞米松刺激以濃度依賴性方式增加了敗血性休克患者T 淋巴細胞的增殖，并顯著降低了miRNA-155 的水平，認為糖皮質激素可能通過miRNA-155 途徑調節T 淋巴細胞的增殖[19]。兒童哮喘的研究發現，miRNA 與長期吸入糖皮質激素反應密切相關，并證明miR-155-5p、miR-532-5p是吸入糖皮質激素反應的潛在藥物基因組學預測因子[20]。本研究結果顯示，經吸入糖皮質激素5d 后，恢復期毛細支氣管炎激素組患兒血miR-302e 的表達水平均顯著高于非激素組，而NF-κB（p65）RNA的表達水平顯著低于非激素組，表明吸入糖皮質激素能上調毛細支氣管炎患兒血miR-302e 的表達水平而下調NF-κB（p65）RNA 的表達水平。

綜上所述，吸入糖皮質激素能上調毛細支氣管炎血miR-302e 的表達，抑制NF-κB RNA 的表達從而發揮抗炎作用，在毛細支氣管炎的治療中具有重要作用。