miR-671-5p調控TIPE2對肺炎鏈球菌誘導肺泡上皮細胞凋亡的影響

黨治國 王海峰 司少魁

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,SP)作為一種革蘭氏陽性細菌,是肺炎最常見的病原菌,可導致高死亡率[1]。當感染肺炎后,肺部會出現較嚴重的炎性反應,作為呼吸道中對抗病原體的天然防線——肺泡上皮細胞會大量凋亡,造成肺損傷[2]。因此,探究SP誘導的肺泡上皮細胞凋亡的分子機制具有重要意義。研究表明,miRNA在肺泡上皮細胞凋亡中發揮重要的調控作用[3]。miR-671-5p作為一種miRNA,已有研究報道,過表達miR-671-5p可加重慢性腎病中的足細胞損傷[4]。腫瘤壞死因子α誘導蛋白8-2(tumor necrosis factor-α induced protein-8-like 2,TIPE2),又稱TNFAIP8L2,其為炎性反應和免疫穩態的關鍵調節因子,其可通過抑制炎癥細胞浸潤來抑制銅綠假單胞菌角膜炎[5]。本研究首先通過生物信息學分析miR-671-5p與TIPE2的關系及miR-671-5p對SP誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響和作用機制。

EMS系統是進行電力調度的能量管理系統。它主要運用在電網模型的簡化和等值上，由于只是對系統模型的分析，其電力調度和電網監控強度值得商榷。實踐是檢驗真理的唯一標準，EMS系統缺乏足夠的實踐監測經驗，其數據的說服力不強。此外，EMS系統適用于相鄰電網的模型分析，對具有實際意義的互聯網電力系統中的電力調度工程分析，精確度和可靠度大為降低。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人肺泡上皮細胞HPAEpiC購自上海慧穎生物公司。

1.2 主要試劑 miR-671-5p抑制物(miR-671-5p inhibitor)及其陰性對照(inhibitor NC)、TIPE2小干擾RNA(si-TIPE2)及其陰性對照(si-NC)均購自廈門慧嘉生物公司;SP(貨號:ATCC 49619)購自上海碩欣生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(貨號:CK04)購自深圳市紐邦生物公司;Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒(貨號:KGA105)購自江蘇凱基生物公司;白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(貨號:EH004)購自上海吉泰依科賽生物公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號:EK-H12145)購自博輝生物科技(廣州)有限公司;白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號:JH-H10327)購自上海繼和生物公司;兔源一抗TIPE2(貨號:ab169616)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax;貨號:ab182733)、半胱氨酸蛋白酶3(Cysteine proteinase3,caspase-3;貨號:ab32351)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;貨號:ab32124)、GAPDH(貨號:ab9485)及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(貨號:ab205718)均購自Abcam公司。

1.3 SP誘導的HPAEpiC細胞模型的構建及分組 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基,在37℃、5% CO2的條件下培養HPAEpiC細胞。取對數生長期的HPAEpiC細胞,分為Ctrl組、SP組、inhibitor NC組、miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組、miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組。inhibitor NC組、miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組、miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組分別利用LipofectamineTM2000試劑將inhibitor NC、miR-671-5p inhibitor、miR-671-5p inhibitor和si-NC、miR-671-5p inhibitor和si-TIPE2轉染于HPAEpiC細胞,轉染48 h后,6組分別再加入菌液1×108CFU/ml的SP處理24 h[6]。Ctrl組為未經任何處理的HPAEpiC細胞,SP組為未轉染只用SP處理24 h的HPAEpiC細胞。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗 分別構建TIPE2野生型質粒(WT-TIPE2)及突變型質粒(MUT-TIPE2),將WT-TIPE2和MUT-TIPE2分別與mimic NC或miR-671-5p mimic共轉染于HPAEpiC細胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔板中,培養48 h時加入10 μl CCK-8試劑,室溫孵育2 h后測量450 nm處吸光度。

When he was 4 years old，his father sent（送）him to school.The boys at school had lessons in Latin（拉丁語）and Greek（希臘語）.They had to work hard.If boys were naughty（調皮的），the teacher beat（打）them.Shakespeare and his friends played in the fields（田 野）.They went fishing and swimming in the river.

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 用胰蛋白酶消化6組細胞后,將細胞用冷PBS洗滌2次,然后重懸于1×結合緩沖液中,在室溫下依次與5 μl FITC Annexin V和5 μl碘化丙啶避光孵育20 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

在肉牛養殖中，由于各種不良應激因素，如突然改變日糧、氣候突變、飼料營養價值較差、飼料發霉變質、圈舍衛生環境不佳等因素存在，均會導致肉牛胃腸道疾病發生，防控不及時，某些傳染性胃腸道疾病還會導致養殖場牛死亡率提升，損害養殖戶經濟效益。

1.8 Western blot檢測蛋白表達 用RIPA裂解緩沖液提取各組細胞的總蛋白,將等量的蛋白質進行電泳、轉膜、封閉后,加入一抗TIPE2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4℃下孵育過夜,再加入HRP標記的二抗孵育1 h,通過ECL試劑檢測蛋白顯色情況,Image J軟件用于分析蛋白條帶灰度值。

1.7 ELISA法檢測細胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平 嚴格按照試劑盒說明書檢測細胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

1.4 qRT-PCR檢測miR-671-5p表達 Trizol試劑用于提取細胞中的總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測miR-671-5p的相對表達水平。miR-671-5p的相對表達水平是以U6為內參,通過2-ΔΔCt方法計算的。引物序列:miR-671-5p:正向引物5’-AGGAAGCCCTGGAGGG-3’,反向引物5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’;U6:正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCATACT-3’,反向引物5’-ACGCTCTCACAATTTGCGTGTC-3’。

2.4 6組HPAEpiC細胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較 與Ctrl組比較,SP組細胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組細胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表4。

2 結果

2.1 6組HPAEpiC細胞中miR-671-5p、TIPE2蛋白表達比較 與Ctrl組比較,SP組細胞中miR-671-5p表達升高,TIPE2蛋白表達降低(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細胞中miR-671-5p表達降低,TIPE2蛋白表達升高(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組細胞中miR-671-5p表達變化差異無統計學意義(P>0.05),TIPE2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1,表1。

The Status Quo of China Provincial Tourism Image Positioning & Type Division_____________________________LU Xiaobo,CHEN Xiaoying,WANG Wanshan et al 1

圖1 Western blot檢測細胞中TIPE2蛋白表達;A Ctrl組;B SP組;C inhibitor NC組;D miR-671-5p inhibitor組;E miR-671-5p inhibitor+ si-NC組;F miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組

表1 6組HPAEpiC細胞中miR-671-5p、TIPE2蛋白表達比較

2.2 6組HPAEpiC細胞增殖能力比較 與Ctrl組比較,SP組細胞OD450值降低(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細胞OD450值升高(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5pinhi bitor+ si-TIPE2組細胞OD450值降低(P<0.05)。見表2。

樹立正確的水生態觀。貫徹黨的十八大和十八屆三中全會精神，堅持“系統治理”，統籌山水林田湖各要素，協調解決水資源、水環境、水生態、水災害問題，牢固樹立生態文明理念，大力推進水生態文明建設，構建水生態文明與經濟社會成果交相輝映的新型人水關系。實施贛撫連通工程，構建贛江、撫河下游江河湖庫水系連通體系，提升水資源調蓄能力、水環境自凈能力和水生態修復能力。抓好南昌、新余等全國水生態文明城市建設試點，在蓮花、會昌等縣開展省級試點，并配合全省“百強鎮”建設開展水生態文明示范鎮、示范村建設。探索建立水生態補償制度，引導社會資本投入水生態文明建設。通過以點帶面，推進全省水生態文明建設。

表2 6組細胞OD450值比較

2.5 6組HPAEpiC細胞中凋亡相關蛋白表達比較 與Ctrl組比較,SP組細胞中Bax、caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組中Bax、caspase-3蛋白表達降低,Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組中Bax、caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3,表5。

表3 6組細胞凋亡率比較

Ctrl組 SP組 inhibitorNC組

表4 6組HPAEpiC細胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

2.3 6組HPAEpiC細胞凋亡率比較 與Ctrl組比較,SP組細胞凋亡率升高(P<0.05);與SP組、inhibitor NC組比較,miR-671-5p inhibitor組細胞凋亡率降低(P<0.05);與miR-671-5p inhibitor組、miR-671-5p inhibitor+ si-NC組比較,miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖2,表3。

圖3 western blot檢測細胞中Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白;A Ctrl組;B SP組;C inhibitor NC組;D miR-671-5p inhibitor組;E miR-671-5p inhibitor+ si-NC組;F miR-671-5p inhibitor+ si-TIPE2組

表5 6組細胞中Bax、caspase-3、Bcl-2蛋白表達比較

2.6 miR-671-5p靶向調控TIPE2 Targetscan預測miR-671-5p與TIPE2存在結合位點,與mimic NC和WT-TIPE2共轉染組比較,miR-671-5p mimic和WT-TIPE2共轉染組細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與mimic NC和MUT-TIPE2共轉染組比較,miR-671-5p mimics和MUT-TIPE2共轉染組細胞熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4,表6。

場地土層屬于同一地貌單元，場地中地基巖土層分布穩定，總體上看層底面坡度<10%，除河溝地段地層有缺失外，各地基土分布相對連續，土體垂向壓縮性相差較小，結合基礎開挖深度及建筑物持力層情況，綜合判斷地基為均勻地基。

圖4 Targetscan預測miR-671-5p與TIPE2的結合位點

表6 熒光素酶活性比較

3 討論

肺炎是一種全球常見的感染性疾病,也是感染患者的主要死亡原因[7]。SP是一種革蘭氏陽性需氧雙球菌,最初定植于鼻咽,然后侵入下呼吸道,引起肺炎[8]。而肺炎可以引起肺上皮細胞凋亡以及炎性反應[9]。IL-6、TNF-α、IL-1β作為常見的炎性細胞因子,已有研究發現,IL-6、TNF-α、IL-1β在肺炎患者的血漿中高表達[10]。Bax、caspase-3、Bcl-2是評估細胞凋亡的常用指標,Bax、caspase-3具有促進細胞凋亡的作用,而Bcl-2在細胞凋亡中發揮抑制作用[11]。本研究利用SP誘導肺上皮細胞HPAEpiC以構建體外肺炎細胞模型,結果顯示,與Ctrl組比較,SP組細胞凋亡率、IL-6、TNF-α、IL-1β水平、Bax、caspase-3蛋白表達升高,而OD450值、Bcl-2蛋白表達降低,提示SP誘導的HPAEpiC細胞大量凋亡,細胞增殖能力減弱,且存在炎性反應。

miRNA是一種非編碼RNA,在基因轉錄和翻譯中起轉錄后調控作用。它可以調節靶基因的轉錄后表達,在生物發育、繁殖、細胞分化、細胞凋亡和發病機制中發揮著至關重要的作用[12]。研究發現,miRNA可以調節多種生命活動,并且多種miRNA已被證明參與調節炎性反應和炎癥性疾病[13]。已有研究顯示,過表達miR-671-5p可減輕缺血再灌注引起的神經炎癥[14]和IL-1β介導的軟骨細胞凋亡、炎癥損傷[15];芍藥苷通過上調miR-671-5p抑制類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞炎性反應[16]。本研究結果顯示,miR-671-5p在SP誘導肺上皮細胞HPAEpiC中高表達,下調miR-671-5p可抑制SP誘導的HPAEpiC細胞炎性反應及細胞凋亡,促進細胞增殖。本研究結果與先前研究的不一致可能是由于miR-671-5p存在組織特異性表達造成的。

TIPE2基因位于1號染色體(1q21.2～1q21.3)上,其是一種炎癥負調節劑,可維持免疫穩態[17]。有研究報道,TIPE2在骨質疏松癥患者中低表達,并且與促炎細胞因子呈負相關[18];肺炎支原體肺炎患兒外周血單個核細胞TIPE2水平明顯降低,TIPE2可能是影響肺炎支原體肺炎發生的獨立危險因素[19];參芪固本顆粒配合GINA階梯方案治療肺脾腎虛型支氣管哮喘療效顯著,其機制與上調外周血單個核細胞中TIPE2表達,抑制炎性反應有關[20];TIPE2過表達顯著減輕了急性肺損傷小鼠肺部炎癥,并抑制肺細胞凋亡[21]。表明TIPE2具有抑制炎性反應及細胞凋亡的作用。本研究結果與上述研究一致的,本研究結果顯示,TIPE2蛋白在SP誘導的HPAEpiC細胞中低表達,而下調miR-671-5p可促進SP誘導的HPAEpiC細胞中TIPE2蛋白表達,推測下調miR-671-5p可能通過促進TIPE2表達抑制SP誘導的HPAEpiC細胞凋亡及炎性反應。為了驗證該推測,本研究在轉染miR-671-5p inhibitor的基礎上再加上TIPE2小干擾RNA進行干預SP誘導的HPAEpiC細胞,結果顯示,沉默TIPE2減弱了下調miR-671-5p對SP誘導的HPAEpiC細胞凋亡及炎性反應的抑制作用。

綜上所述,下調miR-671-5p通過促進TIPE2表達抑制SP誘導的HPAEpiC細胞凋亡及炎性反應,揭示了miR-671-5p在SP誘導的HPAEpiC細胞凋亡及炎性反應中的促進作用,表明miR-671-5p可能成為治療SP誘導的肺炎的有希望的治療靶點。