ApoE基因多態性與2型糖尿病患者頸動脈粥樣硬化斑塊的相關性分析

孟令萃 喬妙 喬利軍 楊爽 賴丹惠 葉思婷 周婷 張建興

2型糖尿病(type 2 diaberes,T2DM)是常見的一種慢性代謝性疾病,且全身動脈粥樣硬化發病率較高,隨著病程進展,常合并腦卒中等嚴重的血管疾病,從而使全身各靶器官受到相應損傷[1]。而動脈粥樣硬化是各級血管病變的早期結構及功能改變,是心腦血管疾病的獨立危險因素,而血脂代謝異常是導致動脈粥樣硬化的重要原因,尤其與低密度脂蛋白(LDL-C)、三酰甘油(TC)增高關系最為密切,同時受性別、年齡及高血壓、吸煙等因素的影響[2]。載脂蛋白E(ApoE)基因具有多態性,是人體重要的載脂蛋白之一,是參與調節血脂代謝的重要因子,其基因多態性與血脂水平密切相關,不同基因型轉錄的蛋白質存在氨基酸的差異,使其對LDL受體的親和力不同,影響脂蛋白代謝和血脂水平,從而影響頸動脈粥樣硬化病變的發生、發展[3]。頸動脈是公認的動脈粥樣硬化的主要觀測部位,動脈粥樣硬化病變程度可通過檢測頸動脈內-中膜厚度(IMT)值及斑塊情況進行評估[4]。探討ApoE基因多態性與頸動脈粥樣硬化的關系,從中發現不同基因型對T2DM患者頸動脈粥樣硬化的影響,找出危險因素和遺傳易感性標志,為臨床早期診斷和預防頸動脈粥樣硬化提供有價值的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年9月至2021年2月我院內科住院的461例患者;其中男263例,女198例;年齡30～79歲,平均年齡(60.78±7.27)歲;其中T2DM患者226例,男136例,女90例;年齡32～77歲,平均年齡(61.02±6.86)歲;非T2DM患者235例,男127例,女108例;年齡30～79歲,平均年齡(60.56±7.65)歲。本研究經廣州中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會審核通過。

1.2 標準

1.2.1 T2DM診斷標準:參照中華醫學會糖尿病學分會2020年制定的《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》[5]:典型糖尿病癥狀伴隨機血糖≥11.1 mmol/L,或空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L;或口服糖耐量試驗餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L,或糖化血紅蛋白(HbA1c)≥6.5%。

1.2.2 納入標準:①糖尿病組符合T2DM的診斷標準;②對照組符合糖尿病排除標準;③入院48 h內接受頸動脈超聲檢查;④具有完整的臨床資料。

1.2.3 排除標準:①心、肺、肝及腎嚴重功能不全;②1型糖尿病;③繼發性糖尿病;④嚴重感染;⑤惡性腫瘤;⑥神經、精神障礙;⑦嚴重風濕;⑧臨床資料不完整。

1.3 方法

1.3.1 基線資料:收集461例患者的性別、年齡、身高與體重[計算體重指數(BMI)]、吸煙史、飲酒史、高血壓史、冠心病史、中風史;實驗室檢測:TG、LDL-C、高度密脂蛋白(HDL-C)、TC、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)及ApoE基因多態性檢測。

1.3.2 ApoE基因測定:患者12 h清晨空腹采集肘靜脈血5 ml置于EDTA抗凝管,提取全血細胞基因組DNA根據血液基因組DNA提取試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司,貨號:NGB-51400)說明書進行。應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術擴增ApoE特定基因片段,參照人類ApoE基因多態性檢測試劑盒(弗元(上海)生物科技有限公司,貨號:FYG-rs429358)進行ApoE基因多態性測定[6]。

1.3.3 血液生化指標檢測:患者空腹12 h后于清晨采集肘靜脈血,加入抗凝管并送到檢驗科檢測,測定TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG(采用7170A型全自動生化分析儀,試劑盒均購自中國上海羅氏診斷產品有限公司)、HbA1c(采用糖化血紅蛋白檢測電泳儀,購自法國Sebia公司)。

1.3.4 頸動脈彩超檢查:患者的超聲檢查均由專業從事血管超聲檢查的醫師完成(工作時間>5年),檢查儀器為Philips Elite彩色多普勒超聲診斷儀(荷蘭),探頭頻率為7～10 MHz,患者采取仰臥位,將枕頭置于頸部,頭后仰,從頸動脈起始處,頸內動脈、頸外動脈連續縱、橫切面檢查,觀察頸動脈至分叉處的內-中膜及斑塊情況。頸動脈分組:根據參考文獻[7]分為2組:①無斑塊組:雙側頸動脈內膜均無斑塊形成,且頸動脈IMT<1.5 mm;②斑塊組:一側或以上IMT≥1.5 mm或內膜有斑塊形成,對于有斑塊形成者,依次測量雙側頸動脈每個獨立斑塊的厚度,將測得的所有獨立斑塊厚度相加后即為頸動脈斑塊Crouse積分[8]。

2 結果

2.1 2組患者一般資料比較 2組患者BMI值、高血壓病史、冠心病史、LDL-C、HDL-C、TG、HbA1c、FBG、頸動脈雙側內-中膜(LIMT、RIMT)和斑塊Crouse積分差異有統計學意義(P<0.05),2組患者間性別比、年齡、吸煙史、飲酒史比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者臨床基本資料比較

2.2 2組患者ApoE基因型及等位基因頻率比較 納入461例患者,共檢出6種基因型(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)及 3 種等位基因(ε2、ε3、ε4)。納入人群ApoE基因分布情況符合H-W遺傳平衡定律和連鎖平衡,可代表整個群體。本研究將基因型分為3個表型組,ε2/2和ε2/3合并為ε2組;基因型ε3/4和ε4/4合并為ε4組。由于ε2/4基因型由等位基因ε2和ε4共同組成,等位基因ε2 和ε4對動脈粥樣硬化的作用相反,不歸入上述各組,故比較基因型頻率時剔除基因型為ε2/4基因型的病例。T2DM組ε3/4 基因型頻率顯著高于非T2DM組,ε3/ε3基因型頻率顯著低于非T2DM組(P<0.05)。T2DM組ε4等位基因表型頻率顯著高于非T2DM組,ε3等位基因表型頻率顯著低于非T2DM組(P<0.05)。見表2、3。

表2 2組患者等位基因表型頻率比較 例(%)

表3 2組患者基因型頻率比較 例(%)

2.3 不同基因型T2DM合并頸動脈斑塊患者血脂水平及頸動脈IMT值、斑塊情況比較 3組等位基因表型間TC、TG、LDL-C水平差異具有顯著性,其中ε4組>ε3組>ε2組(P<0.01);HDL-C水平差異無顯著性(P>0.05),但ε2組>ε3組>ε4組;3組等位基因表型間雙側IMT值及斑塊Crouse積分差異有顯著性,ε4組>ε3組>ε2組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組等位基因血脂及頸動脈IMT、斑塊情況比較

2.4 T2DM合并頸動脈斑塊患者總Crouse積分與危險因素的相關性分析 以T2DM合并頸動脈斑塊患者斑塊Crouse積分為因變量,以各種危險因素為自變量,進行相關性分析,發現年齡、BMI值、高血壓史、冠心病史、中風史、LDL-C、HDL-C、HbA1c、ε4等位基因表型與頸動脈斑塊Crouse積分具有明顯相關性(P<0.05),而吸煙、飲酒、膽固醇、TG、ε3等位基因表型沒有明顯相關性(P>0.05)。見表5。

表5 T2DM患者合并頸動脈斑塊總Crouse積分的相關性分析

2.5 ε4等位基因表型預測T2DM合并頸動脈斑塊風險的ROC曲線 ε4等位基因表型預測T2DM合并頸動脈斑塊形成風險的ROC曲線下面積(AUC)為0.691,敏感度為41.7%,特異度為94.7%,表明ε4等位基因對T2DM合并頸動脈斑塊發生風險有一定的預測價值。見圖1。

圖1 ε4等位基因預測T2DM合并頸動脈斑塊風險的ROC曲線

3 討論

隨著近年人們生活水平日益提高及生活方式的改變,糖尿病的發生率日趨上升,已成為全球關注的健康問題。T2DM患者多為中老年群體,隨年齡增加患病率逐漸增高,常伴有脂質代謝紊亂[9]。有研究表明,脂質代謝異常往往與糖代謝紊亂相比更較前發生,其突出特點為TG水平升高,同時循環游離脂肪酸(FFA)水平伴隨增高,從而進一步加速TG水平的進一步升高,降低與胰島素抵抗相關的血漿HDL-C水平,高TG或低HDL-C水平通過炎癥介導或低HDL-C水平影響胰島β細胞的功能,進而影響胰島素的正常分泌,從而加快T2DM的進展[10,11]。本研究結果表明,與非T2DM患者相比,T2DM患者脂質代謝紊亂更為突出,表現為血脂LDL-C、TG水平明顯增高,而HDL-C水平明顯減低。在T2DM患者中,脂質代謝紊亂的患病率為72%～85%[12],脂蛋白脂酶(LPL)、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)、磷脂轉移蛋白(PTP)、內皮脂酶(EL)和肝脂酶(HL)的活性受胰島素抵抗影響影響,同時還會抑制ApoE的生成率和乳糜微粒的分泌[13]。盡管ApoE基因的研究還有限,但都有力地的證實了ApoE基因與糖尿病脂代謝紊亂密切相關[14]。

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因位于人體第19號染色體上,常見的3種等位基因ε2、ε3和ε4分別表達3種ApoE異構體ApoE2、ApoE3和ApoE4。ApoE基因多態性存在6種不同基因型,包括ε2/2、ε3/e3、ε4/4(3種純合體)和ε2/3、ε3/4、ε2/4(3種雜合體)。ApoE基因是人體日常所需的重要的功能蛋白,通過多態性的蛋白形式參與脂蛋白的轉化與代謝過程,與脂代謝紊亂和動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關[15]。既往研究表明3種蛋白基因亞型因結構不同而對脂質代謝的影響有所不同,其中ε4等位基因攜帶者伴有TC、TG、LDL-C水平的增高,其升高的趨勢為ε4>ε3>ε2[16]。本研究中,T2DM組攜帶ε4等位基因(ε3/4+ε4/4)其TC、TG和LDL-C水平較非T2DM組均升高,提示ε4等位基因與糖尿病患者的代謝密切相關,這可能與糖尿病患者本身脂質代謝紊亂,ApoE等位基因受體活性結合能力減低,從而導致富含TG的脂蛋白分解緩慢,進而肝臟攝取、處理乳糜微粒(CM)、VLDL-C殘粒發生障礙,使血中的TG升高,表現為高TG、TC和LDL-C水平[17]。

既往研究證實,糖尿病機體血糖升高誘導血管內皮細胞發生氧化應激反應和炎性反應,導致內皮依賴性血管收縮及舒張功能障礙,同時誘發粒細胞及單核細胞對內皮細胞的炎性損傷和粘附,從而啟動并促進早期動脈粥樣硬化的發生[18]。同時由于糖尿病患者常伴有代謝異常的危險因素,如年齡、性別、不良生活方式和心血管病家族史等相關因素,常常伴有脂質代謝紊亂,隨著LDL-C升高,促進大量脂質顆粒在細胞內及血管壁上沉積,引起動脈粥樣硬化的早期病理改變,通過LDL-C氧化修飾,大量巨噬細胞吞噬的脂質顆粒卻難以分解,在巨噬細胞內沉積后形成泡沫細胞,泡沫細胞積聚之后形成脂質核心并逐漸形成粥樣硬化斑塊[19]。本研究也證實,T2DM組患者頸動脈內-中膜厚度及頸動脈斑塊Crouse積分明顯增高,同時BMI值增高,合并高血壓及冠心病等代謝紊亂高危因素明顯增多。糖尿病患者動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展存在多樣性,ApoE基因多態性與脂質代謝紊亂和動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關[15]。薈萃分析顯示ApoE基因多態性與頸動脈IMT之間顯著相關,但由于納入的受試者為東亞人群,無白人符合納入標準[20]。因此,關于T2DM患者動脈粥樣硬化的臨床類型需要進一步的遺傳學研究,探索其是否ApoE基因受多態性的影響[21]。

研究證明,ApoE基因ε4等位基因通過升高血漿TG、TC、LDL-C的水平從而影響機體血脂水平,并促進動脈粥樣硬化改變過程[22],本研究中T2DM合并頸動脈斑塊患者中ε4等位基因組攜帶者血清TG、TC、LDL-C較非ε4組高。提示ApoE基因多態性是人群中TG、TC和LDL-C水平存在個體差異的遺傳性決定因素,而ε4等位基因可能就是動脈粥樣硬化的遺傳性易感因子。

本研究中T2DM合并頸動脈斑塊患者與ε4等位基因及年齡、BMI值、高血壓史、冠心病史、中風史、LDL-C、HDL-C具有明顯相關性,同時通過ROC曲線證明ε4等位基因對T2DM患者合并頸動脈斑塊的具有較高診斷價值,且ε4等位基因存在時血脂、頸動脈IMT、頸動脈斑塊Crouse積分明顯增高,因此在2型糖尿病人群中,ε4等位基因與動脈粥樣硬化斑塊有關,提示ε4等位基因可能通過影響T2DM患者的血脂代謝,從而在一定程度上影響動脈粥樣硬化病變的進程。

綜上所述,T2DM患者人群脂代謝紊亂較明顯,而ApoE基因多態性與頸動脈粥樣硬化斑塊的發生發展具有明顯相關性,ε4等位基因對T2DM合并頸動脈斑塊具有較高預測價值。因此,對T2DM人群進行血脂水平動態觀察和ApoE基因多態性檢測,深入研究ApoE的基因表達和調控,有利于對動脈粥樣硬化的早期預測,對其危險因素盡早進行干預,從而預防進一步心腦血管疾病的進展。