miR-149-3p調(diào)控JNK/p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)髓核細(xì)胞凋亡、自噬和炎性反應(yīng)的影響

王惟達(dá) 蔣林 史桂霞

椎間盤(pán)退行性病變是腰椎自然老化、退化的病理過(guò)程,嚴(yán)重影響人們?nèi)粘Ｉ詈凸ぷ鱗1]。髓核組織內(nèi)IL-1β含量增多,研究證實(shí)IL-1β能促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡、自噬,導(dǎo)致腰椎間盤(pán)發(fā)生退化[2]。miR-149家族主要miR-149-3p和miR-149-5p,與疾病發(fā)生密切相關(guān)[3],如IL-1β處理軟骨細(xì)胞后miR-149低表達(dá),上調(diào)miR-149的表達(dá)抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的降解,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[4]。miRNA是近年研究的熱點(diǎn),介導(dǎo)參與髓核細(xì)胞增殖、凋亡、炎性反應(yīng)等過(guò)程,與椎間盤(pán)退行性病變發(fā)展密切相關(guān)[5]。JNK/p38 MAPK信號(hào)通路信號(hào)通路能參與髓核細(xì)胞增殖、凋亡、炎性反應(yīng)等過(guò)程,進(jìn)而影響椎間盤(pán)退行性病變發(fā)展[6]。鑒于此,研究采用IL-1β處理髓核細(xì)胞,探討miR-149-3p可能通過(guò)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;IL-1β購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;miR-NC、miR-149-3p、引物購(gòu)于上海吉瑪公司;p38 MAPK通路激活劑Anisomycin購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司;MTT試劑盒購(gòu)于碧云天公司;凋亡試劑盒購(gòu)于凱基生物公司;Bax抗體、Bcl-2抗體、Beclin 1抗體、LC3II抗體、LC3I抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司、JNK抗體、p38 MAPK抗體、p-JNK抗體、p-p38 MAPK抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-8試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所。

1.2 髓核分離與培養(yǎng) SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證:SCXK(滬)2017-0006。大鼠用10%水合氯醛麻醉處死,對(duì)體表進(jìn)行消毒,將胸腰段脊柱分離暴露椎間盤(pán)位置,取出髓核組織,用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗,用無(wú)菌剪剪成大小1 mm3塊狀,加入0.25%胰蛋白酶消化20 min,離心棄上清,然后加入0.02%Ⅱ型膠原酶消化4 h,濾網(wǎng)過(guò)篩,離心棄上清,然后將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×107/L接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱孵育(培養(yǎng)條件37℃、5% CO2)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)清情況,細(xì)胞融合率為80%可進(jìn)行傳代。取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取大鼠髓核細(xì)胞接種至6孔板中,取IL-1β濃度為10 ng/ml處理24 h,記為IL-1β組,正常培養(yǎng)的髓核細(xì)胞作為Con組;取處理24 h的IL-1β細(xì)胞,將miR-NC、miR-149-3p轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞內(nèi),記為IL-1β+miR-NC組、IL-1β+miR-149-3p組;用IL-1β濃度為10 ng/ml和p38 MAPK通路激活劑Anisomycin濃度為300 ng/ml處理24 h,將miR-149-3p轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞內(nèi),記為IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-149-3p相對(duì)表達(dá)水平 收集各組髓核細(xì)胞,將細(xì)胞與Trizol試劑混合用于提取細(xì)胞中總RNA,將提取的RNA用分光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。取0.5 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照SYBR Green試劑盒配置反應(yīng)體系,通過(guò)PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參,用2-ΔΔCT方法分析miR-149-3p相對(duì)表達(dá)水平。miR-149-3p上游引物:5’-CGGGCGAGGGAGGGACGGGG-3’,下游引物:5’-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3’;U6上游引物:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,下游引物:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 收集各組髓核細(xì)胞然后接種至96孔板中(3×104個(gè)/孔),每孔加入100 μl繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔內(nèi)加入20 μl的MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,倒去培養(yǎng)液,加入150 μl的DMSO試劑,觀察結(jié)晶溶解情況,完全溶解后置于酶標(biāo)儀570 nm處檢測(cè)細(xì)胞吸光度值,計(jì)算細(xì)胞活性=試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組髓核細(xì)胞使用磷酸鹽緩沖液沖洗,3 000 r/min離心5 min,用500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,然后與5 μl的Annexin V-FITC、PI混勻,避光反應(yīng)15～20 min,置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、Beclin 1、LC3II/LC3I、JNK/p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 加入蛋白裂解液提取各組髓核細(xì)胞內(nèi)總蛋白,冰上進(jìn)行操作,BCA法檢測(cè)蛋白樣品濃度,取蛋白樣品加至上樣孔內(nèi),在SDS-PAGE凝膠分析處理蛋白樣品,將樣品轉(zhuǎn)移PVDF膜上,使用脫脂奶粉封閉培養(yǎng)1 h,加入Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶600)、Beclin 1(1∶500)、LC3II(1∶500)、LC3I(1∶500)、JNK(1∶600)、p38 MAPK(1∶600)、p-JNK(1∶600)、p-p38 MAPK(1∶600)抗體4℃過(guò)夜孵育,加入稀釋1∶2 000的二抗室溫孵育1h,然后在PVDF膜內(nèi)加入顯色試劑,顯影、曝光。用Image J軟件分析蛋白密度值,以GAPDH作為內(nèi)參。

1.8 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平 收集各組髓核細(xì)胞然后3 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞上清液,按照TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-8試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)miR-149-3p在IL-1β處理髓核細(xì)胞后的表達(dá) 與Con組相比,IL-1β組內(nèi)miR-149-3p相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與IL-1β+miR-NC組相比,IL-1β+miR-149-3p組內(nèi)miR-149-3p相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-149-3p在IL-1β處理髓核細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響 與Con組相比,IL-1β組內(nèi)細(xì)胞活性、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05);與IL-1β+miR-NC組相比,IL-1β+miR-149-3p組內(nèi)細(xì)胞活性、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表2。

圖1 上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞凋亡和自噬的影響;A 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率;B Western blot檢測(cè)凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響

2.3 上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響 與Con組相比,IL-1β組內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);與IL-1β+miR-NC組相比,IL-1β+miR-149-3p組內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

2.4 miR-149-3p對(duì)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Con組相比,IL-1β組內(nèi)p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05);與IL-1β+miR-NC組相比,IL-1β+miR-149-3p組內(nèi)p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與IL-1β+miR-149-3p組相比,IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin組內(nèi)p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表4。

表4 miR-149-3p對(duì)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 Western blot檢測(cè)miR-149-3p對(duì)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;A Con組;B IL-B組;C IL-1β+miR-NC組;D IL-1β+miR-149-3p組;E IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin組

2.5 加入激活劑Anisomycin可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和炎性反應(yīng)的影響 與IL-1β+miR-149-3p組相比,IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin組內(nèi)細(xì)胞活性、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表達(dá)、TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)圖3和表5。

圖3 加入激活劑Anisomycin可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-149-3p對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞凋亡、自噬的影響;A 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率;B Western blot檢測(cè)PAX1、凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 miR-149-3p可能通過(guò)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)IL-1β處理髓核細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和炎性反應(yīng)的影響

3 討論

炎性細(xì)胞因子IL-1β是白細(xì)胞介素-1家族成員的主要因子之一,能參與機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),影響炎性疾病的發(fā)展[7]。有研究結(jié)果顯示,IL-1β刺激髓核細(xì)胞后能促進(jìn)細(xì)胞凋亡增多,增加炎性因子(TNF-α、IL-6等)的分泌,抑制細(xì)胞增殖,加快椎間盤(pán)退化的發(fā)展[8]。細(xì)胞自噬與椎間盤(pán)退變發(fā)展有關(guān),IL-1β誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞后,Beclin1、LC3II/LC3I等自噬有關(guān)標(biāo)記基因增加,Beclin1可參與自噬前體形成,可與Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡之間的平衡;LC3II/LC3I比值大小可反應(yīng)自噬情況[9]。Bax和Bcl-2是常見(jiàn)的凋亡相關(guān)蛋白,二者相互拮抗可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。本研究采用10 ng/ml的IL-1β刺激大鼠髓核細(xì)胞建立椎間盤(pán)退變模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-1β抑制髓核細(xì)胞活性,增加凋亡率、炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá),Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表達(dá)上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),這與之前的報(bào)道研究結(jié)果一致。

研究結(jié)果顯示,TNF-α刺進(jìn)髓核細(xì)胞后miR-495-3p表達(dá)降低,過(guò)表達(dá)中miR-495-3p能促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),抑制細(xì)胞增殖[11]。Qin等[12]研究結(jié)果顯示,miR-149在脂多糖刺激的髓核細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),miR-149通過(guò)調(diào)控MyD88影響脂多糖誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解、凋亡和炎癥反應(yīng),但是對(duì)IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞的研究機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞后miR-149-3p表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-149-3p能促進(jìn)L-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞活性,降低凋亡率,并抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8,下調(diào)Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),提示上調(diào)miR-149-3p能促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡、自噬和炎性反應(yīng)。

JNK/p38 MAPK信號(hào)通路信號(hào)通路是真核細(xì)胞內(nèi)較為經(jīng)典的信號(hào)通路,在多種生物(增殖、凋亡、炎性反應(yīng)等)過(guò)程中發(fā)揮在作用[13]。有研究結(jié)果顯示,IL-1β刺激髓核細(xì)胞后,p38、JNK和NF-κB信號(hào)通路被激活進(jìn)而促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示,IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)上調(diào),上調(diào)miR-149-3p能降低p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá),說(shuō)明上調(diào)miR-149-3p可能通過(guò)激活JNK/p38 MAPK信號(hào)通路影響IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和炎性反應(yīng)。為探究miR-149-3p是否能通過(guò)調(diào)控JNK/p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用,加入信號(hào)通路激活劑Anisomycin后將過(guò)表達(dá)miR-149-3p轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性降低,增加凋亡率、TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平,增加Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表達(dá),降低Bcl-2蛋白表達(dá),說(shuō)明miR-149-3p通過(guò)激活JNK/p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮L-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞的發(fā)展。

綜上所述,miR-149-3p可能通過(guò)激活JNK/p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞凋亡、自噬和炎性反應(yīng),為探究椎間盤(pán)退行性病變的研究方向提供新的方向。