玉米ZmCCT10耐低氮功能研究

李懿璞，童麗秀，藺雅楠，蘇治軍，包海柱，王富貴，劉劍，屈佳偉，胡樹平，孫繼穎，王志剛，于曉芳，徐明良，高聚林

玉米耐低氮功能研究

李懿璞1,2，童麗秀3，藺雅楠1,2，蘇治軍1,2，包海柱1,2，王富貴2,4，劉劍2,4，屈佳偉1,2，胡樹平2,4，孫繼穎1,2，王志剛1,2，于曉芳1,2，徐明良3，高聚林1,2

1內蒙古農業大學農學院，呼和浩特 010018；2內蒙古自治區高校寒旱區作物種質資源保護與利用工程研究中心，呼和浩特 010018；3中國農業大學農學院，北京 100193；4內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古包頭 014109

【目的】土壤氮素缺乏影響玉米的產量和品質，是中國玉米生產面臨的重大問題。編碼轉錄因子，具有一因多效性，ZmCCT10是調控玉米生長發育和響應非生物脅迫重要的調節因子。解析玉米耐低氮的分子機制、聚合抗性基因，為培育耐低氮和氮高效玉米品種奠定基礎。【方法】通過比較近等基因系在低氮脅迫和完全營養水培條件下與耐低氮脅迫相關的性狀，分析低氮脅迫后的表達模式，選擇在近等基因系表達量差異最大的部位與時間點，進行轉錄組測序。發掘玉米響應耐低氮反應的特征，探究其參與耐低氮反應的分子機制。【結果】在低氮脅迫條件下，近等基因系Y331-ΔTE和Y331的根長性狀、生物量、氮素生理指標顯著差異。其中，不帶有轉座子插入的單倍型Y331-ΔTE的總根長、主胚根長、側根長均顯著長于Y331；根干重、地上部干重、氮積累量、硝酸還原酶活性也顯著高于Y331。在低氮脅迫后，在根部和葉片的表達量均顯著高于對照處理，且近等基因系間的表達量也具有顯著差異，根部和葉片的表達模式也不同。脅迫處理3 h后，在根部的表達量達到峰值，而在葉片的表達量隨脅迫處理時間的增加而持續升高，在脅迫處理后6 h達到峰值。選取0.04 mmol·L-1低氮脅迫處理3 h的根部樣品進行轉錄組測序，生物學重復間的相關系數達0.9以上。GO富集分析表明，低氮脅迫后，參與胺化物合成過程和細胞氮化物代謝過程的基因在近等基因系間的表達量差異顯著。結合差異基因的表達量和表達模式，篩選調控參與玉米耐低氮反應的候選基因。經qRT-PCR驗證，轉錄組測序獲得的與耐低氮相關的、等基因在近等基因系脅迫前后的表達量差異顯著。【結論】是一個以轉錄調控的方式參與玉米耐低氮反應的候選基因。

玉米；；耐低氮；轉錄因子；轉錄組

0 引言

【研究意義】目前，玉米是中國種植面積最大的糧食作物，在保障國家糧食安全中發揮著重要的作用。而土壤基礎肥力低是影響玉米增產的主要因素之一[1]。因此，施用氮肥成為玉米增產的重要措施之一。然而也給生產實踐帶來了問題：氮肥過量施用，不但會導致氮肥利用率下降，生產成本提高，而且還會帶來環境污染等負面問題[2]。因此，國家提出了化肥零增長戰略計劃，在保障糧食豐產的前提下，減少化肥施用量，提高肥料利用率。不同玉米品種的氮利用效率存在差異，通過遺傳學等手段選育氮高效品種是解決糧食生產安全、提高氮效率、降低環境污染的根本途徑[3]。【前人研究進展】CCT基因是指編碼蛋白包含CCT（CONSTANS、CONSTANS-LIKE和TOC1）結構域的基因的統稱。CCT結構域由43—45個氨基酸組成，最早在擬南芥、類基因和（）編碼蛋白的C端被發現，結構保守[4]。該基因編碼的轉錄因子屬于鋅指蛋白超家族[5]，主要參與調控植物光周期反應、晝夜節律反應、光形態建成、產量相關性狀和非生物脅迫響應等功能，具有一因多效性[6]。目前已在水稻、玉米、小麥等作物中克隆了CCT基因。最新研究發現的水稻CCT基因——正調控氮素利用。ZmCCT10轉錄因子參與調控玉米光周期反應、莖腐病抗性、雄穗分支數、節根數、雄性生殖細胞數量等多個生理代謝過程[7-14]。另外，所在區段也是玉米控制氮效率、響應非生物脅迫的熱點區段，通過調控地下節根數來促進根系吸收土壤深層的養分[15-16]。氮代謝速率可以反映作物耐低氮的能力，氮代謝速率受硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）等調節，其中，硝酸還原酶是氮代謝過程中最重要的限速酶。此外，氮素還是葉綠素和輔基（NAD、NADP、FAD）的重要組成成分，從而通過這些物質影響作物的光合作用[17]。目前，在水稻中克隆了與高氮利用效率相關的基因，將其導入粳稻品種可大幅度提高粳稻的氮肥利用率[18]。Ma等[19]研究表明，玉米ZmMPK5蛋白通過與ZmABA2互作調節玉米的耐低氮、耐鹽脅迫、耐干旱等逆境脅迫反應。此外，Yoon等[20]研究表明，玉米bZIP轉錄因子家族參與調控玉米對耐低氮、干旱等非生物脅迫的反應。【本研究切入點】目前，玉米耐低氮研究主要集中在相關性狀QTL的精細定位和候選基因的篩選，然而對參與玉米耐低氮過程的單一基因效應的評價研究較少。【擬解決的關鍵問題】本研究利用前期研究創制的近等基因系的耐低氮性狀測定，結合轉錄組分析，闡明參與玉米耐低氮的分子機制，為選育玉米耐低氮品種，提高氮肥利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用玉米抗莖腐病主效QTL精細定位時構建的近等基因系Y331-ΔTE（上游不帶CACTA轉座子片段的個體）和Y331自交系。

1.2 低氮脅迫處理近等基因系耐低氮性狀調查

2016年在中國農業大學智能人工氣候室和2018 —2020年在內蒙古農業大學農學院日光溫室中進行。采用完全隨機試驗設計，設置完全營養液和低氮脅迫2個處理，4次重復；每個培養缽種植4株玉米苗，每個處理4缽。

首先將充分吸水的玉米種子用10%（v/v）雙氧水浸泡30 min；用無菌去離子水沖洗干凈，再用飽和CaSO4溶液浸泡6—8 h；再次沖洗，轉至鋪有濾紙的托盤上，28℃黑暗條件下催芽。待種子露白后，挑選長勢一致的種子，用濾紙卷好，黑暗培養；當胚芽整齊地伸長至濾紙上方2 cm時，選擇光照16 h/黑暗8 h培養；直至幼苗長出1—2片可見葉時，挑選長勢一致的幼苗，去除胚乳后，移到1/2濃度營養液的培養罐中培養；第二天換成全營養液（Hoagland培養液），隔一天換一次營養液。待玉米水培苗長至三葉期（培養約15 d），用0.04 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O+3.96 mmol·L-1CaCl2代替4.0 mmol·L-1Ca(NO3)2進行低氮脅迫處理，以完全營養液處理的水培苗為對照。脅迫處理一周后測定地上部干重和根部干重；每個處理測量16株，求平均值。收獲水培苗的根系，并掃描成圖片，用WinRHIZO 2004b software、Image J軟件測量根的長度，包括總根長（total root length，TRL）、主胚根長（primary radicle length，PRL）、主干根長（main root length，MRL）及側根長（lateral root length，LTL）。用SPAD-502型便攜式葉綠素儀測量植株第三片葉的葉綠素含量；采用凱氏定氮法測定氮含量；氮積累量＝植株干重×氮含量。采用離體法測定硝酸還原酶活性，繪制標準曲線進行測定。

硝酸還原酶活性（NO2-1·g-1·h-1）=(C-C0)×Vt/(Wf×t)

式中，C為根據回歸曲線計算的NO2-1值；Vt為稀釋倍數；Wf為樣品鮮重（g）；t為反應時間（h）。

1.3 低氮脅迫條件下ZmCCT10的表達分析

選取低氮脅迫和對照處理0、1.5、3和6 h水培苗根和葉片進行基因表達分析，利用植物總RNA提取試劑盒（DP432）（TANGEN，北京）分別提取玉米根部和葉片總RNA，利用? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen，北京）將其反轉錄成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（DDR802A）（TaKaRa，大連）進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）表達分析，3個生物學重復，且每個樣品設置3個技術重復。以玉米（Gene ID：542367）為內參基因，利用2-△△Ct法分析基因的相對表達情況。

1.4 轉錄組分析

經0.04 mmol·L-1低氮脅迫處理3 h后，取根部樣品進行轉錄組測序，每個處理3次生物學重復。利用天根RNA prepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取RNA，選用RIN≈5.5；28s/18s≥1.5；1.7＜OD260/OD280＜2.0的樣品進行轉錄組測序。采用IlluminaNovaSeq 6000平臺進行測序。運用HISAT高效對比系統將測序得到的高質量Clean Data與玉米參考基因組（ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/ release-40/fasta/zea_mays/dna/）進行比對，對12個樣本每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取值（fragments per kilobase per million，FPKM）進行統計。利用DESeq2計算差異比較樣本之間的FPKM比值（fold change）和錯誤發現率adj，以|log2fold change|≥2和adj≤0.05為差異基因篩選標準。

1.5 玉米響應耐低氮脅迫基因的qRT-PCR驗證

根據轉錄組測序分析結果，設計候選基因引物（表1）進行實時熒光定量PCR驗證，方法同1.3。

表1 熒光定量PCR引物

2 結果

2.1 低氮脅迫條件下ZmCCT10近等基因系耐低氮性狀的差異性分析

通過對近等基因系Y331-ΔTE和Y331的水培苗進行耐低氮脅迫相關性狀調查（圖1和圖2）。低氮脅迫條件下，Y331-ΔTE的根系生長狀態明顯好于Y331（圖1-a—c），Y331-ΔTE的總根長（TRL）、主胚根長（PRL）、側根長（LTL）極顯著長于Y331（圖2-a—d），而對照處理下Y331-ΔTE和Y331的根長差異不顯著（圖1-a）。低氮脅迫條件下，Y331-ΔTE的生物量（地上部干重和根的干重）均顯著高于Y331（圖2-e—f）。近等基因系的氮積累量和硝酸還原酶活性均呈下降趨勢，但Y331-ΔTE的氮積累量和硝酸還原酶活性均顯著高于Y331（圖2-h—i）；二者的SPAD值差異不顯著（圖2-g）。結果表明，在低氮脅迫條件下，Y331-ΔTE表現出比Y331更強的抗性，推測可能參與調控玉米耐低氮脅迫過程。

a：Y331-ΔTE和Y331植株。Control：對照，LNS：低氮處理；b：Y331-ΔTE的根系；c：Y331的根系。1：主胚根；2：主干根；總根長減去1和2的部分即為側根

2.2 在低氮脅迫條件下近等基因系ZmCCT10的表達分析

qRT-PCR試驗結果表明，與對照處理相比，在低氮脅迫條件下，近等基因系的葉片和根部的表達模式完全不同（圖3）。0.04 mmol·L-1氮脅迫處理條件下，在Y331-ΔTE和Y331植株葉片的表達量不斷升高，在處理后6 h達到峰值，且在Y331-ΔTE中的相對表達量約是Y331的4倍（圖3-c）。低氮處理3 h后，在Y331-ΔTE根部的表達量達到峰值，然后開始下降，而Y331在低氮處理后表達量變化較小（圖3-d）。比較Y331-ΔTE在0.04 mmol·L-1氮脅迫處理后表達量，根部表達量升高的幅度比葉片大（圖3-c—d）。綜上表明的表達響應低氮脅迫，Y331-ΔTE植株中的表達量變化幅度比Y331更大，表現出更強的抗性。

2.3 在低氮脅迫條件下ZmCCT10近等基因系的轉錄組分析

轉錄組測序的每個處理3次生物學重復間的相關系數達0.9以上（圖4-a），說明轉錄組測序的樣本設置合理，以確保后續的差異基因分析結果的可靠性。與對照Y331相比，低氮脅迫處理后的Y331_S差異表達基因為7 462個，其中，與氮代謝有關的基因有17個；與對照Y331TE（上游不帶CACTA轉座子的單倍型，與Y331-ΔTE相同）相比，低氮脅迫處理后的Y331TE_S差異表達基因為2 156個（圖4-b）。其中，與離子轉運有關的基因有13個，涉及碳氮水解酶、氮化合物代謝與轉運；與氫離子泵活性有關。經聚類分析，在低氮處理后，玉米細胞絲裂元蛋白激酶5（mitogen protein kinases 5，；Gene ID：541618）等7個基因在近等基因系間的表達模式不同（圖4-c）。經GO功能富集分析，以adj≤0.05作為顯著性富集的閾值，比較Y331與Y331_S和Y331TE與Y331TE_S共有的GO路徑，按生物過程、細胞組分和分子功能三大類別各篩選5個與耐低氮相關的GO進行分析，其中，胺生物合成過程（GO：0009309 amine biosynthetic processvalue=6.1×10-6，adj=0.00156）與細胞氮化合物代謝過程（GO：0044270 cellular nitrogen compound catabolic processvalue=1.3×10-4，adj=0.04031）差異顯著（圖4-d），與Y331和Y331TE的GO富集結果比較，篩選出的GO差異不顯著，說明這些GO不存在本底差異。

a：總根長；b：主胚根長；c：主干根長；d：側根長；e：根干重；f：地上部干重；g：SPAD值；h：氮積累量；i：硝酸還原酶活性

圖3 低氮脅迫條件下ZmCCT10在Y331-ΔTE和Y331葉片（a和c）、根部（b和d）的表達分析

a：RNA-Seq樣本間相關性熱圖；b：差異基因韋恩圖；c：差異基因聚類分析；d：GO富集分析柱狀圖

2.4 低氮脅迫條件下差異表達基因的qRT-PCR驗證

從轉錄組測序數據獲取的差異表達基因中，選取聚類分析中對照處理表達模式相同，低氮脅迫處理后表達模式不同的基因進行驗證。低氮脅迫處理后，玉米細胞絲裂元蛋白激酶5基因（）在近等基因系中均上調表達，在Y331-ΔTE中的表達量上升幅度較大，是Y331的1.9倍，表現為正調控（圖5-a）；玉米煙酰胺合成酶3基因（nicotianamine synthase 3，；Gene ID：100285295和玉米b-ZIP轉錄因子44基因（bZIP transcription factor 44，；Gene ID：100285656在近等基因系中下調表達，Y331下調幅度較大，分別下調5.2和3.4倍，而Y331-ΔTE下調均不到1倍。表現為負調控（圖5-b和圖5-d）；玉米煙酰胺合成酶2基因（nicotianamine synthase 2，；Gene ID：541637）在近等基因系間的表達模式則完全不同，在Y331中的表達量下調8.5倍，而在Y331-ΔTE中的表達量則上調2.7倍（圖5-c）。通過qRT-PCR驗證，證實了轉錄組測序數據的可靠性，進一步表明通過調控與氮代謝相關基因的表達，從而調控玉米的耐低氮能力。

圖5 差異表達基因的qRT-PCR的驗證

3 討論

3.1 CCT基因一因多效性與作物產量

CCT基因是一大類基因，編碼的蛋白為轉錄因子，最初研究發現的主要功能是調節作物的光周期反應和開花期。后續研究發現幾個重要的CCT基因在不同的糧食作物中均表現出一因多效性，且解釋的表型變異占比較高，具有較高潛在的育種應用價值。最新克隆的小麥就屬于CCT基因，同時調控小穗數、分蘗數以及單株產量，是小麥增產的一個非常重要的基因[21]。水稻能夠調節水稻的抽穗期、分蘗數、單株產量、耐旱性等性狀，對水稻增產有顯著的促進作用[22-23]。最新研究發現，Ghd7作為一種轉錄抑制因子，能夠直接與氮高效負調控因子基因啟動子和第一個內含子上的2個Evening Element-like基序結合，以協同方式抑制其表達，從而正調控氮素利用。和優良等位基因的組合顯著提高了低氮條件下水稻的氮素利用率和產量，為水稻氮利用的遺傳改良提供了潛在的靶點[24]。是與親緣關系最近的CCT基因，同屬CMF（CCT motif family）亞家族[5-6]。上述這些一因多效的CCT基因均參與調控作物的生長發育、逆境脅迫、產量性狀和其他農藝性狀。本研究表明參與了玉米響應耐低氮脅迫反應，增強了玉米耐低氮的能力，擴大了調控玉米響應非生物脅迫反應的范圍。然而，ZmCCT10蛋白結合的順式作用元件和序列，以及其通過哪些生理生化反應增強了玉米耐低氮的能力，還需進一步研究。

3.2 耐低氮玉米的鑒定與氮高效玉米的選育

玉米耐低氮是復雜的數量性狀，探究玉米耐低氮的分子機制是提高玉米耐低氮能力的重要基礎[25]。通常情況下，根據玉米的生長發育特性，可將玉米耐低氮鑒定分為苗期耐低氮鑒定和全生育期耐低氮鑒定。全生育期鑒定是作物耐逆研究的常規方法，它可以利用產量性狀對玉米的耐低氮特性進行評價。但是，全生育期鑒定受到諸多因素的限制，實踐中，大田條件下土壤含氮量存在較大差異，很難實現唯一差異性原則，在一定程度上影響了耐低氮玉米的鑒選[26-28]。有研究表明，玉米氮素的敏感時期在生育前期，前期對氮素的吸收總量雖不多，卻非常重要[29]。如果玉米苗期嚴重缺乏氮素，將會對產量產生無法彌補的損失[30-31]。本研究利用水培方法，對三葉一心期的玉米進行低氮脅迫，既能準確地控制氮素含量，也可以準確地測量玉米的根部性狀，這是目前解析玉米耐低氮分子機制和耐低氮玉米篩選的主要方法。

玉米氮高效主要分為2種類型：一為高氮高效型；二為低氮高效型。低氮高效型是指在較低的氮素水平環境條件下就能夠實現產量目標，也稱之為耐瘠型品種[32]。大量研究表明，高氮高效型玉米在低氮條件下并不能表現出氮高效，而低氮高效型在高氮水平下卻往往表現出氮高效，這與玉米氮素利用效率和環境因素有關[29]。參與玉米的耐低氮反應，極有可能在高氮條件下也表現為氮高效。耐低氮玉米品種既能節約氮肥，降低肥料對環境的污染，又可以提高土壤肥力低下地區玉米的生產水平。不斷深入對玉米耐低氮分子機制的研究，選育并推廣低氮高效玉米新品種，將對中國現有的玉米生產方式產生深遠的影響。

4 結論

低氮脅迫顯著影響了近等基因系的根長性狀和生物量。低氮脅迫下，玉米葉片和根部的表達量均顯著提高，在葉片中，6 h達到峰值；在根部，3 h達到峰值，且在Y331-ΔTE中的相對表達量顯著高于Y331。低氮脅迫后參與胺化物合成過程和細胞氮化物代謝過程的基因在近等基因系間表達量差異顯著。在低氮脅迫后，對表現為正調控，和表現為負調控，在Y331中的表達量下調8.5倍，而在Y331-ΔTE中的表達量上調2.7倍。表明通過調控與氮代謝相關基因的表達，從而參與了玉米響應耐低氮反應。

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Investigation of Low Nitrogen Tolerance of

LI YiPu1,2, TONG LiXiu3, LIN YaNan1,2, SU Zhijun1,2, BAO HaiZhu1,2, WANG FuGui2,4, LIU Jian2,4, QU JiaWei1,2, HU ShuPing2,4, Sun JiYing1,2, Wang ZhiGang1,2, YU XiaoFang1,2, XU MingLiang3, GAO JuLin1,2

1Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018;2Region Research Center for Conservation and Utilization of Crop Germplasm Resources in Cold and Arid Areas, Hohhot 010018;3College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193;4Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109, Inner Mongolia

【Objective】The lack of soil nitrogen impacts the yield and quality of maize, which is a major problem of maize production in China.encodes the transcription factor, which is pleiotropic. ZmCCT10 is a very important co-factor regulating the growth, development and responding to abiotic stress of maize. The molecular mechanism of maize tolerance to low nitrogen is the basis for breeding maize varieties with low nitrogen tolerance and high nitrogen efficiency.【Method】In this study, we compared the traits those relate to low-nitrogen tolerance, expression pattern ofand transcriptome results ofnear-isogenic lines under low-nitrogen stress and complete nutrient conditions. To analysis the characteristics of【Result】 This study indicated that different alleles ofshowed significant differences in root length traits, biomass and nitrogen physiological traits under low nitrogen stress. The Y331-ΔTE haplotype without transposon insertion ofhad significantly longer total root length, main radicle length and lateral root length than Y331 after low nitrogen stress. What is more, root dry weight, shoot dry weight, nitrogen accumulation and nitrate reductase activity were also significantly higher than Y331. The expression levels ofcontinued to increase and peaked 6 hours after stress treatment. Root samples were collected under 0.04 mmol·L-1low nitrogen stress after 3h for transcriptome sequencing. The correlation coefficients between biological replicates are more than 0.9. GO enrichment analysis showed that the expression levels of amine synthesis process and cellular nitrogen compound catabolic process were significantly different in near-isogenic lines after low nitrogen stress. Combined with the amount and expression pattern of differential genes,-regulated candidate genes involved in low-nitrogen tolerance were selected. qRT-PCR confirmed that the expression levels of,and other genes were significantly different after stress in near-isogenic lines. 【Conclusion】is a candidate gene involved in low nitrogen tolerance in maize and it participates in the low-nitrogen tolerance response of maize as transcriptional regulation.

maize;; low nitrogen resistance; transcription factor; transcriptome

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.06.002

2022-12-09；

2022-12-27

內蒙古自然科學基金（2020BS03036）、內蒙古自治區直屬高校基本科研業務費項目（BR22-11-02）、內蒙古自治區高等學校科學研究項目（NJZY19048）、內蒙古農業大學高層次人才引進科研啟動項目（NDYB2018-12）

李懿璞，E-mail：liyipu1987@163.com。童麗秀，E-mail：lixiu_tong2016@163.com。李懿璞和童麗秀為同等貢獻作者。通信作者于曉芳，E-mail：yuxiaofang75@163.com。通信作者徐明良，E-mail：mxu@cau.edu.cn。通信作者高聚林，E-mail：nmgaojulin@163.com

（責任編輯 李莉）