胃腸間質(zhì)瘤不同中醫(yī)證型的免疫組化因子表達(dá)及臨床意義

羅教秀 儲 兵 孟鳳嬌 林綺璐

廣東省中山市人民醫(yī)院病理科，廣東中山 528403

胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是常見的間葉源性腫瘤，其在胃腸道惡性腫瘤中占1%～3%，好發(fā)于50～70歲人群[1]。其預(yù)后通常與危險程度分級、病例分期、腫瘤直徑等因素有關(guān)，近年來，人們對GIST的關(guān)注日漸提高，該疾病的診斷、治療、新藥研發(fā)等均具有諸多進(jìn)展[2]。C-kit原癌基因蛋白 117（C-kit proto-oncogene protein，CD117）、CD34是診斷GIST指標(biāo)中具有較高診斷價值的免疫組化標(biāo)志物，抗原Ki-67是良、惡性腫瘤診斷、預(yù)后評估的指標(biāo)[3]。對于GIST，我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并無相關(guān)描述，而近年來有部分學(xué)者將GIST歸類于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“息肉”范疇。基于此，本研究對60例GIST患者CD117、CD34、Ki-67的表達(dá)情況進(jìn)行分析，分析其與GIST患者中醫(yī)證型的關(guān)系，旨在探討中醫(yī)不同證型之間客觀指標(biāo)的差異，分析其中醫(yī)證型與相關(guān)免疫組化因子的關(guān)系，為臨床中西醫(yī)結(jié)合診斷、治療GIST提供方向。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2月至2021年10月于中山市人民醫(yī)院（我院）就診的胃腸道間質(zhì)瘤患者60例作為研究對象。其中男29例，女31例，年齡27～81歲，平均（57.42±6.39）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢測確診為GIST；②符合《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]、《中醫(yī)常見證診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]中息肉相關(guān)診斷依據(jù)；③手術(shù)獲取的組織蠟片材料充足；④患者臨床資料齊全；⑤患者均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前均接受過放療、化療、手術(shù)切除以及中醫(yī)藥治療等；②合并其他部位的腫瘤；③合并嚴(yán)重心、肺、腎等重要器官功能障礙；④存在精神疾病無法配合研究等。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要設(shè)備、材料及操作方法 兔抗人CD117多克隆抗體、兔抗人CD34分子抗體、Ki-67細(xì)胞增殖檢測試劑盒均購于上海長嘉生物科技有限公司；兔抗人Ki-67多克隆抗體、通用型兩步法檢測試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液均購于上海長嘉生物科技有限公司；DAB免疫組織化學(xué)顯色試劑盒購于上海長嘉生物科技有限公司；蘇木素購自北京索萊寶科技有限公司、防脫玻片購于南通市甄選醫(yī)療科技有限公司、Roche Benchmark XT/ULTRA全自動多功能免疫組化檢測系統(tǒng)儀（瑞士羅氏）、RM2245是半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國徠卡）、EG1160一體式石蠟包埋機(jī)（德國徠卡）；BX41光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS）。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行：①切片。對石蠟包埋組織進(jìn)行切片，切片厚度約為4 μm，每個切片3張，分為Ki-67組、CD34組、CD117組。②脫蠟。將切片浸泡在二甲苯中，每次浸泡30 min，重復(fù)2次；再放在無水乙醇中浸泡5 min，重復(fù)2次；放在95%乙醇中浸泡5 min，2次；置于濃度80%乙醇中浸泡5 min；置于75%乙醇中浸泡5 min，最后用蒸餾水沖洗5 min。③抗原修復(fù)。將切片浸泡在pH值為8的EDTA抗原修復(fù)液中，修復(fù)3 min以保持切片濕潤。用磷酸鹽緩沖液洗滌3次切片，每次3 min。④抗原修復(fù)與暴露切片。切片放在檸檬酸緩沖液中浸泡后，置于微波爐內(nèi)進(jìn)行加熱以修復(fù)抗原，時間12 min。隨后取出切片在室溫內(nèi)冷卻，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。⑤滴加抗體。在切片上滴加適量一抗，置于4℃環(huán)境中孵育過夜。取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，在滴加相應(yīng)的二抗，在室溫37℃環(huán)境中孵育60 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。⑥顯色復(fù)染。在切片上滴加顯色劑顯色3～5 min后用蒸餾水沖洗，并在切片上滴加Mayer蘇木精溶液復(fù)染1 min，水洗5 min，最后按照乙醇梯度法對切片進(jìn)行脫水，并用中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組化染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 高倍顯微鏡下觀察，存在棕色顆粒染色細(xì)胞為陽性細(xì)胞，免疫組化指標(biāo)陽性表達(dá)率計算方法：選取免疫組化染色較強(qiáng)的區(qū)域10個進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，共觀察1000個細(xì)胞，陽性表達(dá)率=所觀察陽性細(xì)胞總數(shù)/1000×100%。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

觀察組織標(biāo)本免疫組化鏡下CD117、CD34、Ki-67的表達(dá)情況；比較GIST患者不同臨床特征及中醫(yī)證型CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)情況；采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)不同中醫(yī)證型GIST與CD117、CD34、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。

患者中醫(yī)證型評估標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前，參考《中醫(yī)常見證診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]對患者進(jìn)行中醫(yī)證型判斷，患者中醫(yī)證型主要分為濕熱內(nèi)阻、脾虛濕瘀、脾胃氣虛三種。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行t檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測結(jié)果

納入的60例GIST患者中，GIST組織CD117陽性率為90.00%（54/60）、CD34陽性率為81.67%（49/60）、Ki-67陽性率為 70.00%（42/60）。

2.2 GIST患者不同臨床特征及中醫(yī)證型CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)情況比較

不同的年齡、性別、核分裂數(shù)患者CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)率及不同腫瘤直徑、危險程度患者CD117、CD34陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；不同腫瘤直徑、危險程度患者Ki-67陽性表達(dá)率及不同中醫(yī)證型患者CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 GIST患者不同臨床特征及中醫(yī)證型CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)情況比較[n（%）]

2.3 GIST中醫(yī)證型與CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman系數(shù)檢驗(yàn)，GIST患者各中醫(yī)證型比例分別與 CD117呈正相關(guān)（P＜ 0.05），與 CD34、Ki-67陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05）。見表2。

表2 GIST中醫(yī)證型與CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

GIST是外國學(xué)者Clark和Mazur教授于1983年首次提出[6]，是一組起源于腸道內(nèi)原始的多潛能肝細(xì)胞中的腫瘤，該腫瘤具有自身特征的形態(tài)學(xué)、遺傳特性以及免疫表型等，其多向分化的特性，導(dǎo)致其在生物學(xué)上難以預(yù)估[7]。GIST在以往的報道中并不常見，其在胃腸道腫瘤中占比不到1%[8]，它們起源于位于肌肉層內(nèi)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞，其特征在于酪氨酸激酶受體KIT的過表達(dá)[9]。未轉(zhuǎn)移的GIST的標(biāo)準(zhǔn)治療是手術(shù)切除，具有轉(zhuǎn)移的GIST通常僅通過酪氨酸激酶抑制劑治療而無法根治；因此，早期診斷是改善其預(yù)后的唯一方法。隨著我國醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前臨床上中西醫(yī)結(jié)合應(yīng)用于GIST治療中，但關(guān)于GIST的中醫(yī)證型及患者臨床特征、免疫組化因子等相關(guān)研究仍較為少見。基于此，本研究對60例GIST患者腫瘤組織CD117、CD34、Ki-67的表達(dá)情況及其中醫(yī)證型情況進(jìn)行探討，旨在為中西醫(yī)結(jié)合治療GIST提供新思路。

本研究結(jié)果顯示，CD117、CD34、Ki-67在GIST組織中均具有較高的陽性表達(dá)率，Ki-67的表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)。在GIST的發(fā)生，中心事件主要為C-kit原癌基因突變[9]，而CD117是C-kit的表達(dá)產(chǎn)物，是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，是GIST常用的免疫組化指標(biāo)，對GIST具有較高的診斷特異度，其在GIST中表達(dá)陽性率為90%以上，CD34是骨髓造血干細(xì)胞抗原，是一種糖基化跨膜蛋白，在GIST中陽性表達(dá)率為70%～89%，其特異度較CD117稍差[10]，與本研究結(jié)果一致。本研究中，不同腫瘤直徑、危險程度患者Ki-67陽性表達(dá)率存在明顯差異。Ki-67是一種分布在細(xì)胞核內(nèi)，與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其被認(rèn)為與細(xì)胞分裂有關(guān)，可作為一種腫瘤良惡性、侵襲行為以及預(yù)后的標(biāo)志性指標(biāo)，同時也是細(xì)胞分裂和增殖活動的一種標(biāo)志物[11-12]。相關(guān)研究報道，Ki-67的表達(dá)水平與GIST危險程度分級存在密切的相關(guān)性[13]，與本研究結(jié)果一致。相關(guān)研究[14]報道，CD117、CD34、Ki-67在雖然GIST組織中同樣具有較高的陽性表達(dá)率，但其與患者預(yù)后無關(guān)。其中原因可能為GIST的發(fā)生與發(fā)展不是一個簡單的過程，個體之間存在差異，因此還有待進(jìn)一步的研究。

中醫(yī)藥歷史悠久，在治療胃腸功能障礙方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[15]，而中醫(yī)藥在GIST的診療中必將會占一席之地。基于此，應(yīng)盡早統(tǒng)一GIST在中醫(yī)理論中所屬范疇，總結(jié)其中醫(yī)證型。然而，GIST在中醫(yī)理論中并無相關(guān)論述，以往臨床常以主證作為其病名，如GIST患者主訴胃脘隱痛，故有學(xué)者將其納入“胃痛”范疇；若以反酸為主訴癥狀，則被納入為“吐酸”范疇；若以胃脘脹滿為主訴癥狀，則納入“痞滿”范疇；因此，并不利于臨床對疾病的判斷。而本研究中，依據(jù)《中醫(yī)常見證診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]中相關(guān)證型描述，同時，林益群等[16]表明，GIST本質(zhì)為脾虛，其還具有痰濕、血瘀、熱度等證，初期患者多為濕熱瘀實(shí)，久之則為正氣虛，因此本研究中所納入患者主要可分為脾胃氣虛、脾虛濕瘀、濕熱內(nèi)阻三種證型。本研究中，對不同中醫(yī)證型的GIST及其CD117、CD34、Ki-67的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不同中醫(yī)證型患者CD117、CD34、Ki-67陽性表達(dá)率存在相關(guān)性。由此可見，對GIST組織細(xì)胞CD117、CD34、Ki-67表達(dá)情況進(jìn)行檢測，或可對患者中醫(yī)證型的鑒別與診斷具有一定的價值。但其中具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，檢測CD117、CD34、Ki-67的表達(dá)情況對GIST患者中醫(yī)證型的診斷與鑒別具有重要意義，Ki-67陽性表達(dá)與腫瘤直徑、危險程度有關(guān)，可作為評估GIST預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)。然而本研究中僅對GIST組織CD117、CD34、Ki-67三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了免疫組化檢測，僅可將GIST組織區(qū)別于其他腫瘤組織或健康組織，并未對其量化檢測；同時關(guān)于三項(xiàng)指標(biāo)與患者中醫(yī)證型相關(guān)性的機(jī)制尚未闡明，仍需進(jìn)行更深入的研究。