基于網絡藥理學技術探究紅花治療關節炎的潛在機制

張瑋杰

鄭州大學第五附屬醫院藥學部，河南鄭州 450052

關節炎是多因素共同作用后引起的炎性疾病，其臨床表現及診治時長都給患者的日常生活帶來諸多不便。菊科植物紅花具有止痛散腫，活血潤燥的功效。臨床上多用于跌撲損傷、瘡瘍腫痛等。諸多含紅花成分的中成藥在老年人風濕骨痛治療方面發揮重要作用，如紅花油、紅花如意丸等。因此，紅花在治療關節炎方面具有較高的應用前景。網絡藥理學作為一門新興學科，可以從生物網絡平衡角度，解釋疾病的發生發展，為指導新藥的研發提供諸多便利[1]。另外，網絡藥理學整體性、系統性的特點與中醫整體觀、辨證論治原則十分契合[2]，這為探究中藥的作用機制提供更好的思路和方法。基于此，本研究運用網絡藥理學技術，對紅花治療關節炎的機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 紅花活性成分及靶標蛋白的篩選

在中藥系統藥理學分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com）檢索紅花的活性成分及對應靶點。活性成分的篩選標準是口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 和 類 藥 性（drug like，DL）≥0.18。靶標蛋白和基因信息通過Uniprot（https: //www.uniprot.org/）數據庫作標準化校正。

1.2 關節炎相關靶點的篩選

通過 GeneCards（https: //www.genecards.org/）數據庫獲取疾病的相關基因，并以“arthritis”為檢索詞語，進行檢索和篩選。

1.3 靶點網絡構建

運用Cytoscape 3.7.2進行“藥物-成分-疾病-靶點”的網絡構建，進行中心性分析。

1.4 蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction networks，PPI）的構建和核心靶點的篩選

將交集靶點傳輸到STRING（https: //string-db.org/）數據庫，選取分值＞0.9的高置信度區間，獲取蛋白相互作用網絡。并通過Cytoscape 3.7.2進行可視化處理。

1.5 紅花治療關節炎的通路篩選

將潛在作用靶點通過R 4.0.1軟件，進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，篩選條件限定為P＜ 0.05。

2 結果

2.1 紅花主要活性成分篩選結果

TCMSP數據庫獲得紅花成分共189個，根據OB≥30%和DL≥0.18獲取目標活性化合物22個。檢索這189個紅花成分對應的藥物靶點，共得到1466個，篩選出主要活性成分對應的靶點并去重，得到對應的靶點蛋白共186個。

2.2 紅花治療關節炎潛在靶點的篩選結果

以“arthritis”為關鍵詞，運用GeneCards數據庫進行檢索，將物種選擇為人類，獲得關節炎相關的靶點6532個。將紅花和關節炎相關靶點導入在線韋恩圖得到交集靶點（圖1）。可以看出紅花和關節炎的共同靶點有156個。

圖1 紅花潛在靶點和關節炎疾病靶點的韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點網絡構建

利用Cytoscape 3.7.2軟件將紅花及其活性化合物、靶點之間的關系可視化（圖2）。利用Network Analyzer插件分析各節點的網絡參數，通過綜合考慮節點關系，篩選出排名前十的主要活性成分，分別是槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素、β-胡蘿卜素、豆甾醇、β-谷固醇、6-羥基山奈酚、六羥黃酮和植物固醇。

圖2 “藥物-成分-疾病-靶點”相互作用網絡圖

2.4 PPI的構建和潛在關鍵靶點的篩選

將藥物與疾病交集靶點上傳到STRING數據庫得到PPI網絡圖（圖3A）。該網絡共有156個節點蛋白，以連接節點數為篩選標準，篩選出30個基因，將其進行可視化（圖3B）。篩選出排名前十的靶點基因，其分別是 JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL6、APP、MAPK8、CXCL8、FOS和 EGFR。

圖3 PPI圖

2.5 潛在靶點的GO富集分析和KEGG通路分析

通過 R 4.0.1，以P＜ 0.05，q＜ 0.05 為篩選條件，進行GO功能富集分析。將富集程度最高的前20條通路制作成條形圖（圖4A）。GO富集分析結果表明紅花與關節炎交集基因的功能主要是影響某些生物因子的活性，以及部分受體的結合。根據基因比（富集基因占所有靶基因的比例）篩選出排名前10的富集分析結果，它們是DNA結合轉錄因子結合核受體活性（DNA-binding transcription factor binding nuclear receptor activity）、核 受 體 活 性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉錄因子活性（ligandactivated transcription factor activity）、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA結合（RNA polymeraseⅡ-specific DNA-binding）、轉 錄 因 子 結 合（transcription factor binding）、細 胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、轉錄輔激 活 子 結 合（transcription coactivator binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、轉錄輔助因子結 合（transcription cofactor binding）、藥 物 結 合（drug binding）、抑制轉錄因子結合（repressing transcription factor binding）。

通過R 4.0.1，將交集基因進行KEGG通路富集分析，選取前20條通路制成條形圖（圖4B）。KEGG通路分析結果顯示紅花和關節炎交集的基因主要涉及一些炎癥及癌癥相關的代謝通路。根據基因比篩選出排名前10的富集分析結果，它們是糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、流體剪切應力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨細胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、IL-17 信 號 通 路（IL-17 signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、膀胱癌（bladder cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）。

圖4 紅花治療關節炎潛在基因通路分析結果

3 討論

紅花作為一味常用的活血調經類中藥，無論是單一使用還是復方配伍，均發揮重要作用。本研究基于網絡藥理學技術，探究紅花治療關節炎的潛在機制。通過藥物-成分-疾病-靶點網絡的構建，篩選出紅花治療關節炎的主要活性成分。根據化合物分子結構可以將這些活性成分分為黃酮、黃酮醇和甾醇等。黃酮類化合物是最豐富的酚類化合物，具有抗氧化、抗炎和免疫調節的特性[3-5]。飲食中的類黃酮可減輕關節炎相關癥狀[6]。槲皮素作為具有較強抗炎和免疫抑制的生物活性類黃酮，是治療類風濕性關節炎的潛在藥物[7]。有研究發現木犀草素可通過抑制Raf1活性來減輕關節炎中性粒細胞的氧化應激[8]。有證據表明山奈酚可減輕關節炎模型小鼠的關節炎嚴重程度[9]。黃芩素可以通過減弱核因子（nuclear factor，NF）-κB的活性并抑制炎癥細胞因子和趨化因子的表達來發揮抗氧化和抗炎活性[10]。有研究報道合適地攝取β-胡蘿卜素可以預防NLRP3炎性體質相關疾病，如關節炎、痛風等[11]。β-谷固醇和歐前胡素可以協同作用緩解膠原蛋白誘發的關節炎[12]。綜上，通過網絡藥理學篩選出的槲皮素、木犀草素等紅花中的活性成分，在關節炎治療過程中發揮重要作用，且大部分化合物的作用效果也已得到實驗證實。

關節炎是人體自身免疫性疾病，其炎癥細胞因子的合成失衡會導致人體的軟骨和骨遭到破壞[13]。長期關節炎的折磨，顯著增加中老年人患抑郁癥的概率[14]。通過PPI網絡分析，發現JUN、AKT1、MAPK1、RELA和IL-6等是紅花治療關節炎的關鍵靶點。MAPK是傳遞細胞信號的重要一步，它可以參與調節細胞的炎癥反應等多種細胞生理及病理過程。RELA作為NF-κB的亞單位，可以參與許多細胞的生物學進程，其中就包括炎癥和免疫等。通過靶向NF-κB可用于關節炎的治療[15-16]。研究發現槲皮素可以通過MAPK和NF-κB信號通路達到抑制ARPE-19細胞中由IL-1β誘導的炎性細胞因子和趨化因子的產生[17]。且槲皮素能降低穩定型冠狀動脈疾病中NF-κB的轉錄活性[18]。以上研究都為探究槲皮素通過靶向NF-κB治療關節炎提供依據。

GO富集分析結果表明紅花與關節炎交集基因的功能主要影響某些生物因子的活性以及部分受體的結合，這與前面篩選出的核心靶標基因一致，表明紅花中的活性成分很可能通過靶向MAPK1、RELA等關鍵靶點干擾細胞因子等大分子的結合功能。KEGG信號通路分析結果顯示關鍵靶標基因主要參與的信號通路為糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等。許多研究表明，炎癥細胞因子是關節炎的誘因，MAPK、NF-κB等信號通路是與關節炎相關的信號通路[13，19]。

綜上所述，紅花通過其主要活性成分槲皮素、木犀草素，作用于MAPK1、RELA等一系列關鍵靶點，促進細胞因子以及大分子間相互結合，從而使AGE-RAGE信號通路等多條通路發生變化，從而發揮治療關節炎的作用。這也體現出了中藥中的多成分、多靶點、多通路的作用特點。