基于網絡藥理學探究功勞木治療嚴重蜂蜇傷的作用機制及分子對接研究

韋廷求 楊勝淋 肖俊新 廖華鋒 蔣小方

1.廣西壯族自治區柳州市中醫醫院重癥醫學科，廣西柳州 545001；2.廣西壯族自治區桂林市人民醫院血液內科，廣西桂林 541000；3.廣西壯族自治區桂林市中醫醫院重癥醫學科，廣西桂林 541000

蜂蜇傷是急診常見疾病代表，主要表現為局部皮膚紅腫、刺痛、瘙癢，傷口處有瘀斑、瘀點等癥狀[1]，輕者可自行消退，重者可迅速出現多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[2-3]，此外，毒液在蜜蜂叮咬部位的強效溶解酶作用會導致皮膚層明顯局部水腫和壞死[4]。大黃蜂、黃蜂和蜜蜂造成的死亡占動物相關死亡總數的29.7%[5]。近年來，蜂蜇傷呈逐年上升趨勢，成為一個日益嚴重的公共衛生問題[2，6]。

功勞木別名眾多，土黃連為其別名之一。本課題組采用土黃連膏（土黃連干燥莖研磨，芝麻油調成膏狀）外敷傷口聯合CRRT治療重癥蜂蜇傷，均取得較理想的效果。通過臨床觀察，發現早期使用土黃連膏外敷傷口可減少機體對蜂毒的吸收，促進皮損恢復正常，這可能與功勞木的生物堿成分發揮作用有關，但具體作用機制尚不清楚。本研究通過網絡藥理學與分子對接技術預測功勞木治療蜂蜇傷的核心靶點及機制，為后續試驗研究提供理論基礎和新思路。

1 資料與方法

1.1 功勞木化學活性成分篩選

1.1.1 搜索功勞木的活性成分并預測活性成分的潛在靶點 首先利用化學專業數據庫（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/）搜索“功勞木”的化學成分，再通過中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM）（http://bionet.ncpsb.org.cn/BATMANTCM/），以 Score cutoff≥ 20，AdjustedP≤ 0.05 為標準篩選功勞木活性成分及其對應的靶點。同時以“Mahoniae Caulis”“功勞木”為關鍵詞在PubMed（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、知網進行文獻挖掘中藥活性成分及其對應靶點，與中藥數據庫BATMAN-TCM和化學專業數據庫互為補充和核對。

1.1.2 篩選得到功勞木化學活性成分對應的靶點 在PubChem中搜索1.1.1項下所得化合物的異構體SMILES號，并將其在在線數據庫SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，將排名前15位的基因作為功勞木的可能作用靶點，與1.1.1項下得到的靶標進行補充和去重，得到藥物成分的靶標。

1.2 疾病靶標的預測

通過人類基因綜合數據庫GeneCards（https://www.genecards.org/），以“bee sting”為關鍵詞搜索，得到疾病相關基因。

1.3 功勞木治療蜂蜇傷疾病靶點蛋白質相互作用網絡（PPI）的構建及核心靶點的獲取

將1.1.2項下得到的藥物成分的靶標與GeneCards數據庫得到的疾病相關基因取交集，將交集靶點通過STRING數據庫構建PPI網絡，置信度設置為0.7。用Cytoscape 3.9.10及其MCODE聚類插件獲取網絡核心靶點。

1.4 分子對接

借助PubChem數據庫、ChemBio3D Ultra 14.0軟件獲取核心成分.mol2格式。將核心靶點通過蛋白數據庫（protein data bank，PDB）（https://www.rcsb.org/）獲取蛋白晶體結構并以.pdb格式保存。借助軟件PyMoL 1.7.2.1去除蛋白的水分子，分離配體和受體，通過AutoDock Tools 1.5.6軟件轉換為.pdbqt格式，并尋找對接活性口袋，設置Gridbox坐標及大小。利用Vina進行分子對接，同時得到結合能打分值。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

以P＜ 0.05為條件，將核心靶點進行GO和KEGG富集分析，并篩選重要GO條目及通路繪圖。

2 結果

2.1 功勞木活性成分的預測

獲得功勞木核心活性成分4個，分別為異粉防己堿、木蘭花堿、藥根堿、尖刺堿。

2.2 疾病靶標的預測

將得到的174個活性成分靶點與GeneCards平臺獲得的226個疾病相關靶點取交集，最終獲得功勞木治療蜂蜇傷的潛在靶點22個。

2.3 PPI網絡的構建和核心靶點的獲取以及疾病-藥材-成分-靶點網絡的構建

PPI網絡圖見圖1A。使用MCODE聚類插件獲得功勞木治療蜂蜇傷疾病的8個核心靶點，分別為SLC6A4、ALOX5、HTR2B、HTR2C、HTR2A、PLA2G4A、PLA2G2A、PLA2G1B，見圖1B。最后采用Cytoscape軟件構建疾病-藥物-成分-靶點網絡，見圖2。

圖1 功勞木治療蜂蜇傷PPI網絡（A）及關鍵靶點（B）

圖2 功勞木治療蜂蜇傷的疾病-藥物-成分-靶點網絡

2.4 分子對接

配體與受體結合能小于0便可自發結合，結合能＜-5.0 kcal/mol則具有較佳的結合活性。分子對接結果顯示核心靶點與核心成分結合能力較強，詳見表1。

表1 有效活性成分和核心靶點對接評分

2.5 GO和KEGG通路富集分析

用R軟件對8個核心靶點進行GO富集分析，結果見圖3。KEGG富集分析結果顯示，排在前20位的通路包括5-羥色胺能突觸通路、花生四烯酸（AA）代謝通路、TRP通道的炎癥介質調節通路等，見圖4。

圖3 功勞木治療蜂蜇傷核心靶點的GO富集分析

圖4 功勞木治療蜂蜇傷核心靶點的KEGG富集分析

3 討論

現代研究表明功勞木的生物堿類成分具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗神經退行性疾病等多方面活性[7]。蜂毒成分復雜多樣[8-9]，包括激肽類（肥大細胞脫顆粒肽等）、生物胺類（乙酰膽堿、組胺等）和酶類（膽堿酯酶、磷脂酶、蛋白酶等）等。蜂毒致病機制復雜，具體機制尚不清楚，血液凈化是目前治療蜂蜇傷的有效治療手段，《胡蜂蟄傷規范化診治中國專家共識》指出基礎治療亦非常重要[10]，但這些治療要求特定的醫療環境與醫療設備，嚴重蜂蜇傷后短時間內很難得到血液凈化治療，而中醫藥具有簡、便、廉、驗的特點，蜂蜇傷后可快速進行土黃連膏外敷治療，減少毒素吸收。

通過網絡藥理學分析得到核心成分和核心靶點，分子對接技術顯示核心成分與核心靶點具有良好的結合活性。KEGG富集分析的重要通路中，花生四烯酸代謝通路、TRP通道的炎癥介質通路為5-羥色胺能突觸通路的下游通路。肥大細胞脫粒肽是蜂毒的一種主要成分，可誘導肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺、血清素（5-HT），一旦從突觸前軸突末端釋放，5-HT就會與其中一個受體5-HT2（Gq偶聯）結合，使磷脂酶A2（PLA2）活化，在脂氧合酶（ALOX5）的催化下，使膜卵磷脂水解產生AA，隨后AA被代謝成具有生物活性的親脂性化合物（類花生酸），類二十烷酸，包括前列腺素和白三烯，可調節血流動力學、炎癥反應等[11-12]。PLA2水解膜卵磷脂還可以產生溶血磷脂，引起溶血[13]。

PLA2G2A為PLA2家族的成員，主要靶向細胞外磷脂，影響宿主抗菌防御、炎癥反應和組織再生[14]。異粉防己堿可通過Gq蛋白抑制PLA2酶活化[15]。藥根堿具有減輕氧化損傷、保護神經作用[16]。木蘭花堿具有較強的抗氧化和抗炎特性[17]。尖刺堿是有效的ALOX5抑制劑，具有抗氧化特性[17]。嚴重蜂蜇傷導致急危重癥，主要是因為皮膚接種了大量毒液，引起劇烈的炎癥反應以及溶血等，導致肌纖維損傷引發重要器官功能紊亂[18]。

綜上所述，功勞木治療蜂蜇傷的分子機制可能是其有效活性成分參與調控5-羥色胺能突觸通路、AA代謝通路、TRP通道的炎癥介質調節通路等，調節關鍵靶點發揮抗溶血、抗炎、抗氧化等治療作用。