基于網絡藥理學探究金芪降糖片治療2型糖尿病作用機制

趙夢瑤 潘芊鈺 曹 穎

天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種代謝疾病，長期表現出高血糖的水平，受遺傳因素和環境因素等多因素長期作用的影響，臨床表現為血中的葡萄糖水平維持在較高的狀態，多飲、多食、多尿、消瘦等。調查研究表明，目前我國糖尿病患病率較高，為11.2%[1]。因T2DM早期癥狀隱匿、并發癥多，涉及神經、心腦血管等多個全身系統，且T2DM常引起并發癥，如高血壓、腎臟疾病等，嚴重危害國民健康。

中醫藥治療T2DM旨在治療“消渴”病癥。隨著中醫對T2DM的觀察研究，提出可以根據病程將T2DM分為四個時期：脾癉；（熱中）消中、鬲消、腎燥；消渴；消癉[2]。經過長期的治療和探索，中醫前輩們總結出了以下幾種辯證論治：肺熱傷津，潤肺生津為主；清熱生津，益氣養陰為主；益氣養陰，補益脾腎為主[3]。同時采用分時論治，單藥治療，針灸療法等治療手段。金芪降糖片是基于《備急千金要方》中的復方黃連丸結合現代臨床研究開發的中成藥，臨床上用于治療糖尿病安全且有效，有清熱益氣的功效，多用于治療口渴多飲、氣短乏力的氣虛內熱型消渴病[4]。臨床上金芪降糖片對輕、中型非胰島素依賴型糖尿病能達到良好的治療效果，但其作用機制尚不完全明確[5]。

網絡藥理學結合生物信息學、藥理學等多種學科，基于多種數據庫能夠初步揭示中藥有效成分與疾病之間的關系[6]。本研究采用網絡藥理學的方法，初步研究金芪降糖片治療T2DM相關靶點的作用機制，為臨床研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 金芪降糖片活性成分篩選及其作用靶點的預測

選擇TCMSP數據庫，以金芪降糖片中三味中藥作為關鍵詞進行檢索，得到活性成分及作用靶點。篩選標準設置為口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）。將得到的有效成分進行相關靶點收集，得到的關鍵成分代入有機小分子生物活性數據庫（PubChem）檢索得到每個成分的分子結構式，通過小分子藥物靶點預測在線平臺數據庫（Swiss Target Prediction）對每個成分進行靶點預測，使用蛋白質（Uniprot）數據庫對靶點基因名進行規范。

1.2 T2DM靶點的獲取

以“type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞，使用OMIM數據庫、GeneCards數據庫，檢索T2DM的靶點，整合相關靶基因并刪除重復靶點。

1.3 金芪降糖片治療T2DM潛在作用靶點預測

通過Venny 2.1工具分析1.1和1.2項下得到的數據集并繪制韋恩圖，得到藥物-疾病共同靶點，即金芪降糖片作用于T2DM的預測靶點。

1.4 藥物-成分-靶點網絡構建

應用Cytoscape 3.7.2軟件對金芪降糖片活性成分及治療T2DM的預測靶點構建“藥物-成分-靶點”網絡圖。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

在STRING數據庫中輸入1.3項下得到的交集靶點，設置物種為“Homosapiens”，中等置信度（medium confidence）為0.4，構建PPI網絡。利用Cystoscap 3.7.2軟件對PPI網絡拓撲分析，對PPI網絡中的節點評價，分值大于平均分的基因即為金芪降糖片T2DM的核心靶點。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析

使用基因富集分析工具David 6.8，篩選標準設置為P＜ 0.05，對上述得到的交集靶點導入分析工具，對其進行GO和KEGG富集分析，并將結果可視化處理，繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 金芪降糖片活性成分篩選和靶點預測

利用TCMSP數據庫檢索并進行條件篩選，得到金芪降糖片活性成分371個，黃連48個，黃芪87個，金銀花236個。因每個成分可以作用于多個靶點，因此所得靶點存在重復值，合并數據庫檢索結果去重后，共得到活性成分54個，相關靶點697個。

2.2 T2DM潛在靶點預測

檢 索OMIM數 據 庫、GeneCards數 據 庫、DrugBank數據庫，匯總整理各數據庫結果并剔除重復靶點，累計得到T2DM潛在靶點838個，利用Uniprot數據庫修正全部靶點基因名。

2.3 金芪降糖片治療T2DM潛在作用靶點

將上述得到的藥物成分靶點與疾病靶點取交集，得到86個共同靶點，即為金芪降糖片治療T2DM的潛在靶點，通過Venny 2.1繪制韋恩圖（圖1）。

圖1 金芪降糖片與T2DM靶點韋恩圖

2.4 藥物-成分-靶點網絡構建

在Cytoscape 3.7.2軟件中導入2.1項下的54個活性成分與2.3項下的86個交集靶點，剔除與T2DM靶點無關成分的相關靶點，繪制“藥物-成分-靶點”作用網絡圖（圖2）。

圖2 藥物-成分-靶點作用網絡圖

2.5 PPI網絡構建

將2.3項下的86個交集靶點上傳至STRING數據庫，下載TSV文本數據結果，再代入Cytoscape 3.7.2對結果進行可視化，構建PPI網絡圖（圖3）。以度、介數中心性、平均最短路徑長度、接近中心性4個參數為基礎進行篩選，共86個節點、813條邊，平均度值為18.9，節點平均介數中心性為0.595。以度值進行排序，得到37個靶點分值大于平均分，將排名前30的靶點使用R 3.6.1繪制條形圖（圖4）。

圖3 金芪降糖片與T2DM關鍵靶點PPI網絡圖

圖4 PPI拓撲分析的核心靶點排序（排名前30）

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

對86個共同靶點進行GO富集分析得到1855個GO條目（P≤0.05），結果顯示，主要富集于生物學過程（biological process，BP），共1722條富集條目，包括肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、肽激素反應、上皮細胞增殖、絲氨酸磷酸化等（表1）；細胞組分（cellular component，CC）有32條富集條目，靶點參與最多的是主要作用于膜筏、膜微區；分子功能（molecular function，MF）有101條富集條目，參與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等過程。選取排名前10的GO條目繪制氣泡圖（圖5）。

圖5 金芪降糖片治療T2DM的GO富集分析

表1 金芪降糖片治療T2DM的GO生物過程分析

KEGG富集得到147條信號通路，將排名前20的通路可視化，繪制氣泡圖（圖6），顏色越紅表明顯著性越高，關鍵通路有癌癥中的蛋白多糖、前列腺癌、胰島素抵抗HIF-1信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、內分泌抵抗等。

圖6 金芪降糖片治療T2DM的KEGG富集分析

3 討論

金芪降糖片是治療消渴癥的經典名方，方中具有苦寒藥性的黃連為君藥，有清中焦濕熱、瀉火解毒的功效，以甘溫藥性的黃芪做為臣藥來調和藥性，黃芪善補肺氣、益衛氣，有提升運轉之功，可調節臟腑功能，補脾健胃。金銀花藥性甘寒，長于清熱解毒，在方中作為佐藥，可以輔助黃連來增強清熱瀉火之效，諸藥配伍精妙，共奏益氣固本、標本兼治之功[7]。臨床用于治療以口渴多飲、氣虛乏力為表征的T2DM，療效較為理想[8]。大多數糖尿病患者的病因未知，但常伴有炎癥過程，破壞免疫微環境穩態等。方中黃連中的小檗堿、木蘭花堿；黃芪中的黃芪甲苷；金銀花中的咖啡酸、綠原酸、木犀草苷等，可以起到抗炎、調節免疫細胞穩態的作用[9]。

本研究通過網絡藥理學方法篩選了金芪降糖片的54個有效成分，預測86個治療T2DM的潛在靶點。根據PPI拓撲分析發現，蛋白激酶B1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等可能是金芪降糖片發揮作用的核心靶點。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可以通過調節免疫相關途徑，發揮抗炎、抗氧化應激，調節血脂、血糖水平等作用，從而可以用于輔助治療T2DM[10]。MAPK1會在腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導劑在骨骼肌細胞激活，還參與了細胞的增殖、基因表達分化、存活和凋亡等多種免疫調節，免疫反應可以調節糖尿病患者的高血糖、氧化應激、生長因子等水平[9]。因此，推測金芪降糖片通過作用于核心靶點，參與多種生物過程發揮降糖作用。GO功能富集分析顯示，在生物過程中肽基酪氨酸磷酸化和修飾起到重要作用，肽基酪氨酸是胰島素受體和胰島素受體底物中的重要成分。整個過程首先是肽基酪氨酸磷酸化，從而會使受體底物上的酪氨酸被殘基化，其次磷酸化的P13K被激活后會作用于AKT，結果會導致細胞膜上的脂質雙分子層磷酸化，血液中的葡萄糖轉運到細胞內，通過負反饋調節來達到降低血糖的目的[11-12]。在細胞組分中，重點通路集中在膜筏、膜微區和膜區，并且細胞膜是這三種細胞組分主要存在的位置，細胞膜上富含多種離子通道與跨膜轉運體，其中與T2DM有關的離子通道、跨膜轉運體包括鈣離子通道、ATP敏感型鉀離子通道、葡萄糖轉運體4、ATP結合轉運體等[13]。由此推測金芪降糖片中的活性成分通過影響細胞膜上膜筏、膜區和膜微區上離子通道及跨膜轉運體的活性，影響葡萄糖從血液到細胞中的轉運，影響肝糖原、肌糖原的合成[14]。分子功能中通路是蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶作為Rho家族中GTP酶的重要效應物，能夠參與多種細胞生物學過程，包括細胞轉化、細胞形態學和動力學[13]。黃連素為黃連、黃芪中的主要成分，可以作用于蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶靶點，其主要目的是影響細胞膜上的GLUT4轉運體，減輕胰島素抵抗[9]。

綜上，推測金芪降糖片通過多途徑協同發揮降糖作用。KEGG通路結果表明，其最主要的通路是癌癥中的蛋白多糖，可以抑制腫瘤細胞增殖和直接殺傷腫瘤細胞，參與相關細胞代謝、免疫反應等生理活動。癌癥中的蛋白多糖能夠改善細胞的糖脂代謝，抑制炎性因子釋放，進而減輕胰島素抵抗[15]。本研究基于網絡藥理學的方法，篩選得到金芪降糖片治療T2DM的活性成分、靶點和通路，初步揭示金芪降糖片治療T2DM的作用機制。結果表明，其發揮作用是通過多通路、多靶點共同參與，為臨床應用的進一步研究提供理論依據。