海南羅勒精油成分及其抗氧化作用評價

周 欣 宋 寧 弓 寶 林 景▲

1.海南省第五人民醫院制劑科，海南?？?570206；2.河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州 450046；3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所海南分所（海南省南藥資源保護與開發重點實驗室&國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室），海南?？?570311

羅勒為熱帶、亞熱帶草本植物，其來源于唇形科羅勒屬植物羅勒（Ocimnm basilicum L.），又名九層塔、蘭香、香草等，目前在我國華南、華東等多省區均有分布[1]。在我國傳統醫學中，羅勒常用于治療胃腸不適、外感風寒、中暑、跌打損傷以及風濕性關節炎等癥[2]；而東南亞國家如泰國、越南等在食品加工、餐飲等行業常將羅勒作為香辛調料使用。羅勒的莖、葉富含特殊氣味的芳香精油，這既是羅勒的主要化學成分，也是其發揮功效的主要內在活性物質。種植企業對羅勒的栽培均旨在提高其精油成分含量方面，并通過精油單體分離生產出供藥用或調香用的原料[3]。近年來羅勒在我國規?；耘喾N植面積增加，栽培的品種主要為5個種和3個變種，而不同來源的羅勒品種其化學成分及生物活性相差較大[4]。海南地處亞熱帶和熱帶交接處，其獨特的氣候區域，使本地產的羅勒與其他省份所產的羅勒品種有所區別[5]，目前尚未有相關文獻對海南羅勒的化學成分及生物活性進行報道。

本研究利用氣質聯用（GC-MS）技術對水蒸氣蒸餾法提取的海南羅勒精油進行成分分析，并對其抗氧化活性進行評測，以期為海南羅勒的開發提供參考。

1 儀器與材料

樣品于2021年6月采集于海南萬寧興隆南藥園內的羅勒地上部分，經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所王德立研究員鑒定為唇形科羅勒屬植物Ocimum basilicum L.，采收后放置通風陰涼干燥處待用；氣相色譜質譜聯用儀（GC-7890A，MS-5975C-MSD，美國安捷倫公司），HP-5MS色譜柱（5%Benzomethylsiloxane，30 m×0.25 mm×0.25μm）；揮發油提取裝置；96孔板（Gracia Chemical Technology Co.Ltd）；酶標儀（美國Thermo公司）；分析天平（Mettler-Toledo Instruments，Ltd）；移液器（20 μl，200 μl，DRAGON-MED）；乙醚（Diethyl）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、無水乙醇（Ethanol）、無水硫酸鈉（Sodium Sulfate）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、氯化鐵（Ferric Chloride）均為廣州化學試劑廠生產。

2 方法

2.1 海南羅勒精油GC-MS分析

2.1.1 海南羅勒精油提取制備 參照賈小麗等[6]水蒸氣蒸餾提取羅勒精油的方法進行樣品的提取。將陰干后的海南羅勒全草粉碎成粗粉，稱取100 g置入圓底燒瓶中，使用揮發油提取裝置，采用水蒸氣蒸餾法進行精油提取和收集，油水混合液使用乙醚萃取后用無水Na2SO4干燥，然后揮干乙醚，獲得可流動的淡黃色精油0.2%（g/g）。

2.1.2 儀器分析條件 參考文獻報道[7-8]，對氣相色譜儀進行分析條件的設置，從50℃開始升溫，以每分鐘2℃速率升溫至180℃，再以每分鐘5℃升溫至280℃；選用氦氣作為載氣；色譜柱的流量為每分鐘1.0 ml，進樣口溫度為250℃；分流比為100∶1。EI源：電離電壓為70 eV的，離子源溫度為230℃，掃描范圍：50～ 500 amu；進樣量為 1.0 μl，按照上述分析條件進行分析鑒定，應用NIST譜庫檢索和質譜分析相結合的方法進行化學成分的確認，同時使用面積歸一化法對各組分的相對含量進行計算。

2.2 海南羅勒精油的抗氧化作用評價

2.2.1 DPPH自由基清除率的測定 TPTZ工作液配制[9-10]：按照10∶1∶1的比例，將pH為3.6的醋酸鈉緩沖溶液（3 μmol/L）、TPTZ（10 mmol/L）、氯化鐵溶液（20 mmol/L）新鮮配制后，混合均勻。自由基清除率的測定：取100 μl DPPH的乙醇稀釋液（6.5×10-5mol/L）置于96孔板中，同時加入10 μl精油，混勻后，設定在517 nm波長下進行測定，重復3次計算平均吸收值，并按照下列公式計算：

式中：A0為DPPH溶液100 μl+蒸餾水10 μl的吸光度；A1為 DPPH 液 100 μl+10 μl精油的吸光度；A2為10 μl精油+100 μl無水乙醇的吸光度。

2.2.2 評價海南羅勒精油抗氧化能力 在96孔板中加入10 μl海南羅勒精油，同時加入TPTZ工作液150 μl，混勻后，在538 nm波長處測定吸光度。以FeSO4為對照標準物質，以其濃度為橫坐標，紫外吸收度為縱坐標繪制標準曲線，計算得出回歸方程。將海南羅勒油的抗氧化能力以換算的FRAP值表示，以1 FRAP單位與1 μmol/L FeSO4的抗氧化能力相對等，即單位體積下海南羅勒精油的抗氧化能力相當于FeSO4的物質的量（μmol/L）。

3 結果

3.1 海南羅勒揮發油中的成分分析

結果共鑒定出化學成分27種，其中萜烯類成分占海南羅勒精油總量的78.24%。具體成分及相對含量見表1。

表1 海南羅勒精油中主要成分及相對含量

3.2 海南羅勒精油抗氧化能力評價

以FeSO4為對照標準物質，以其濃度為橫坐標，紫外吸收度為縱坐標繪制標準曲線，通過計算得出回歸方程如下：y=0.0022x+0.4545，相關系數R2=0.9987，見圖 1。

圖1 以FeSO4為標準物質繪制標準曲線

海南羅勒精油對DPPH自由基的清除能力及抗氧化能力測定見圖2～3。從圖2結果可以看出，海南羅勒精油對DPPH自由基的清除隨著時間的推移而逐步增強，在50 min時對DPPH自由基的清除率可達到59.10%，說明海南羅勒精油可清除DPPH自由基且清除能力較好。從圖3結果可以得出，海南羅勒精油抗氧化能力較好，且其抗氧化能力隨著時間增加而增長，至60 min時可達到313.50 μmol/L。

圖2 海南羅勒精油對DPPH自由基的清除能力（%）

圖3 海南羅勒精油的抗氧化能力（μmol/L）

4 討論

目前全世界羅勒屬植物有150余種[4]，常規種有疏柔毛羅勒、丁香羅勒、檸檬羅勒等。近年來隨著我國羅勒引種栽培面積的逐年增加，對羅勒揮發油的生物活性及臨床應用研究逐漸受到了人們的關注。已有研究報道羅勒揮發油具有較好的抑菌、抗炎作用[4]，抗抑郁作用[11-12]，臨床可用于治療慢性腹瀉[13]、不孕癥[14]等，在我國維藥等少數民族醫學里，羅勒還被認為具有降血糖、抗血栓、降血脂等作用[15]。

據報道，不同栽培種及變種的羅勒，其揮發油成分類別及含量有一定差異，而植物精油的化學成分和含量又與其生物活性關系密切[4]，如亳州疏毛羅勒揮發油中萜類物質占60.61%，其對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有很好的抑菌效果[16]；漳州產的甜羅勒以及云南產的甜羅勒揮發油中芳樟醇、丁香酚等含量均較高[8，17]，而甜羅勒對高血壓患者療效較好[18]；大型羅勒精油中香葉醛含量較高，能較好地清除自由基[19]；丁香羅勒揮發油中丁香酚含量較高，其在抗氧化性及抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌能力方面較強[11]。張帥等[20]對兩廣以及浙江等地的羅勒進行了成分檢測，發現共有成分中成分含量差異可達10倍以上，在抗抗菌活性方面也有很大的區別。

本研究采用傳統水蒸氣蒸餾的方法對海南羅勒精油進行提取，并對其進行主要成分的分析和比對，共鑒定出27個化學成分，主要以萜烯類化學成分為主，相對含量較大的成分有反-3-苯基-2-丙烯酸甲酯（25.60%）、p-烯丙基茴香醚（23.43%）、β-芳樟醇（14.24%）等，這與文獻報道的其他區域羅勒精油成分有很大差異[21]。反-3-苯基-2-丙烯酸甲酯作為高級香料添加劑，在食品、日用化妝品等領域被廣泛使用，但其合成品存在合成效率低以及副反應多等問題[22-24]，因此是否能將海南羅勒作為其生產的原料來源值得深入探討。如今，尋找更安全、更有效的天然抗氧化產品是很多產業尤其是食品工業關注的焦點[24]，實驗表明，海南羅勒精油具有較好的抗氧化活性，短時間內清除自由基的能力可達到50%以上，因此海南羅勒具備作為新一代天然、安全抗氧化劑原料的開發潛力。

本研究僅對海南羅勒成分及清除自由基能力進行了初步的分析和觀察，對海南羅勒的抗菌能力以及藥效活性成分分析等工作尚未完成，后期課題組將針對其藥效作用及物質基礎進行更深層次的探索。