小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白EnouOBP17與食誘劑成分的分子對接研究

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收稿日期：2023-04-20

基金項目：貴州省教育廳自然科學研究項目（黔教合KY字〔2020〕193號）；黔南州科技計劃項目（黔南科合〔2018〕14號）。

作者簡介：周爽爽（1988—），女，貴州甕安人，碩士，講師，從事植物保護教學和研究。E-mail：zhoushuangshuang@sgmtu.edu.cn。

周爽爽.小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白EnouOBP17與食誘劑成分的分子對接研究[J].南方農業(yè)，2023，17（21）：1-6，11.

摘 要 為探究小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白EonuOBP17與13種食誘劑成分的結合模式和結合能力，給小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白分子識別機制研究和食誘劑的廣泛篩選提供新路徑，采用MOE軟件進行了分子對接實驗。結果表明：EonuOBP17與12種食誘劑成分有較好的結合能力，僅與DMNT結合較弱。其中，十六烷與EonuOBP17的結合能最低，親和力最強；苯甲醛與EonuOBP17的結合能最高，親和力較弱。并探明了EonuOBP17蛋白與化合物分子作用的氨基酸位點情況。EnouOBP17可以作為食誘劑進一步篩選的靶標蛋白。

關鍵詞 小貫小綠葉蟬；氣味結合蛋白；食誘劑；分子對接

中圖分類號：S435.711；[Q816] 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.21.001

在中國茶樹栽培生產中，各茶產區(qū)均有茶小綠葉蟬分布，為害較重[1]，其中小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）又名假眼小綠葉蟬，是為害尤為突出的主要種群[2-3]；其成蟲、若蟲刺吸茶樹汁液，常致茶樹葉片焦黃、枯萎，是導致茶樹生長遲滯、減產的重要因素[4-5]。小貫小綠葉蟬的防控研究一直是茶園植物保護領域的重點[1，6]。

以茶樹揮發(fā)物為研究基礎的食誘劑開發(fā)是當前茶樹害蟲綠色防控的研究熱點之一[7-10]。隨著分子技術和計算機綜合應用的發(fā)展，利用蛋白模型與配體進行分子對接是一種便利高效地研究蛋白質結合功能的方法，可在分子計算層面顯示受體蛋白與配體分子的相互作用[11-13]。由此比較不同蛋白質與配體結合的差異性，也可以比較不同化合物與同一蛋白的結合能力，進一步篩選有利用價值的蛋白和化合物分子[14-15]。在昆蟲嗅覺感受系統(tǒng)中，氣味結合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）是一類主要行使化合物分子識別和運輸功能的水溶性蛋白[16-17]。OBPs蛋白氨基酸序列具有保守性和多變性，研究表明不同OBPs蛋白與環(huán)境中的揮發(fā)性化合物結合存在一定的特異性[18-20]。以OBPs蛋白為靶標，采用分子對接技術研究其與不同揮發(fā)性化合物的結合能力，可為引誘劑或驅避劑開發(fā)提供理論基礎，提高篩選效率。

本實驗對EnouOBP17蛋白模型與食誘劑成分開展分子對接研究，旨在闡明EnouOBP17與食誘劑分子的結合模式和結合能力。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 蛋白模型準備

通過AlphaFold蛋白結構數據庫（https：//www.alphafold.ebi.ac.uk/）獲得小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白EnouOBP17的三維結構模型[21]。在UCLA網站（http：//services.mbi.ucla.edu/）上利用評估程序對蛋白模型的質量進行檢測。ERRAT程序主要是統(tǒng)計0.35 nm范圍內蛋白質不同類型原子間形成的非共價鍵數據，結果必須大于50%[22]。Verify-3D程序主要統(tǒng)計大于或等于0.2氨基酸3D-1D的相容性分值，結果必須超過80%[23]。ProCheck程序以拉氏構象圖體現蛋白質模型立體化學質量，處于最佳區(qū)域和額外允許區(qū)域的氨基酸殘基數量超過90%，視為模型結構可靠[24]。

1.1.2" 配體化合物準備

查閱文獻收集了13種茶小綠葉蟬食誘劑成分[25-30]，列于表1；通過有機小分子生物活性數據PubChem分子庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢，獲得13種化合物的二維結構（SDF格式文件）用于分子對接實驗。

1.2" 方法

分子對接：本研究采用MOE（Molecular Operating Environment）軟件進行對接。對接模式選擇Induced Fit，Placement選擇Alpha PMI，Rescoring1選擇Alpha HB，Refinement選擇GridMin，Refinement2選擇ASE[31]。

親和力判斷：根據結合能評分（S）和相互作用情況綜合判斷受體和配體間的親和力。

2" 結果與分析

2.1" 蛋白的三維結構模型評估分析

在AlphaFold蛋白結構數據庫下載得到EonuOBP17的三維結構模型。ProCheck程序顯示處于最佳區(qū)域和額外允許區(qū)域的氨基酸殘基數量為99.4%，模型結構可靠（見圖1）；Verify-3D程序結果超過80%，表明蛋白模型質量合理（見圖2）；ERRAT 程序結果為82.68%，說明蛋白模型整體合理（見圖3）。綜合評估表明，EonuOBP17的蛋白三維結構模型可以用于分子對接研究。

2.2" 分子對接結果分析

2.2.1" 分子對接相互作用

對接結果（見表2）顯示，EonuOBP17與十六烷、α-法呢烯、壬醛、芳樟醇、牻牛兒醇、苯甲酸乙酯、（E）-羅勒烯、檸檬烯、（Z）-3-己烯醇、（E）-2-己烯醛、（Z）-3-己烯醇醋酸酯、苯甲醛等12種化合物具有實際的相互作用；EonuOBP17與DMNT在不同構象下都未檢測到分子間的相互作用。

2.2.2" 分子對接結合能

由表2可知，EonuOBP17與12個食誘劑成分分子對接的結合能得分（S）均為負值，說明EonuOBP17與這些化合物分子間的相互作用都是自發(fā)的、穩(wěn)定的。且結合能越低，說明受體蛋白與配體間的結合越好。此次對接實驗結果表明，在12種有實際分子間相互作用的食誘劑成分中，十六烷與EonuOBP17的結合能最低，親和力最強；苯甲醛與EonuOBP17的結合能最高，親和力較弱。

2.2.3" 分子間結合位點和作用方式

由表2可知，十六烷、檸檬烯2種化合物與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點都是極性氨基酸His55，相互作用方式都是H-pi；壬醛、牻牛兒醇、（E）-2-己烯醛3種化合物與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點一致，均涉及非極性氨基酸Ala37和極性氨基酸His191兩個氨基酸位點，但相互作用方式有差異，壬醛和（E）-2-己烯醛都是H-acceptor，牻牛兒醇是H-acceptor和H-donor兩種。（Z）-3-己烯醇與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點只有極性氨基酸His191，相互作用方式為H-acceptor。α-法呢烯、芳樟醇、苯甲酸乙酯、（E）-羅勒烯、（Z）-3-己烯醇醋酸酯、苯甲醛與EonuOBP17相互作用的氨基酸位點與上述化合物均不相同，這6個化合物與蛋白結合的氨基酸位點也互不相同。

EonuOBP17蛋白與化合物分子作用的氨基酸位點情況統(tǒng)計列于表3，涉及5種氨基酸，非極性氨基酸3種，3個Ala，2個Phe，2個Pro；極性氨基酸2種，6個His，2個Lys。

3" 討論與結論

3.1" 討論

本研究用的EnouOBP17蛋白三維結構模型是由AlphaFold預測的。AlphaFold是DeepMind的AlphaFold團隊開發(fā)的一種人工智能程序，旨在使用深度學習技術預測蛋白質的三維結構。蛋白質是關鍵的生物分子，在人體中發(fā)揮各種作用，包括催化化學反應的酶和傳遞信息的信號蛋白。蛋白質的結構，即其氨基酸的折疊和相互作用方式，決定了它的功能。與此相對應的實驗方法，如X射線晶體學和核磁共振（NMR）光譜學，非常耗時、昂貴，且常常產生低質量的結果。AlphaFold旨在通過快速、準確地預測蛋白質結構來解決這個問題。該程序使用深度神經網絡在公開蛋白質數據上進行訓練，以基于氨基酸序列進行預測。AlphaFold的預測已通過實驗數據進行基準測試，并表現出卓越的準確性，超過了該領域中其他方法的表現。AlphaFold的發(fā)展在生物化學領域具有重要意義，因為它可以通過提供更準確、更具成本效益的方法來確定蛋白質結構，加速新藥物和療法的發(fā)現。

蛋白功能的研究方法多樣，分子對接已成為常用方法之一。由于同一家族或同一類蛋白，氨基酸序列一般具有相似性和保守性，因此可利用同源模建原理模擬得到蛋白質模型[32]。蛋白三維結構模型可經第三方軟件對模型評分（SAVES v5.0），共六個評估程序，三個或三個以上的程序評估通過才算合格的模型。本研究用的EnouOBP17蛋白三維結構模型在SAVES v5.0中，同時經過ERRAT、Verify-3D、ProCheck三個程序的評價要求，確保了結構模型合理性，為分子對接實驗增加可靠度。

在食誘劑成分的篩選中，對傳統(tǒng)的電生理實驗、行為選擇實驗、熒光競爭結合實驗等已有較多研究報道[33]。這些實驗方法對實驗平臺的要求較高，且較為耗時費力。應用計算生物學技術模擬得到蛋白模型，在虛擬狀態(tài)下測算受體蛋白與化合物小分子間的親和力，也可以篩選有潛在利用價值的蛋白或化合物。本研究的分子對接實驗表明，EnouOBP17與大部分已報道的小貫小綠葉蟬食誘劑均有較好的結合能力，說明EnouOBP17可以作為食誘劑進一步篩選的靶標蛋白。

分子對接的基本原理是對接計算，根據分子結構和物理參數，利用計算機計算預測分子間的相互作用。在多種結構變換下，受體和配體間分子接觸面最大程度發(fā)生相互作用，結構和分子間作用力都處于最優(yōu)狀態(tài)。因此，蛋白與配體化合物結合能大小與蛋白的三維結構、小分子配體的相對分子質量及其所含有的官能團有關[34]。表1中食誘劑成分化合物的分子量排序與表2中對接結合能的排序相似度極大，例如分子量最大的十六烷，與EnouOBP17對接有實際的分子間相互作用，且結合能也是12種物質中最高的。這與常延斌等[34]研究得出的配體和受體親和力大小與配體相對分子質量的大小有關的觀點相一致。

一般極性氨基酸（親水）是在蛋白結構性和功能性方面發(fā)揮重要作用，非極性氨基酸（疏水）在蛋白結構形成中較為關鍵，常位于核心區(qū)域。對接結果顯示，His、Ala、Lys、Phe、Pro這5種氨基酸可能是EnouOBP17的關鍵氨基酸殘基，在EnouOBP17結合氣味分子中發(fā)揮著重要作用。

十六烷、α-法呢烯、壬醛、芳樟醇、牻牛兒醇、苯甲酸乙酯、（E）-羅勒烯、（Z）-3-己烯醇醋酸酯、檸檬烯、（Z）-3-己烯醇、（E）-2-己烯醛、苯甲醛等與EnouOBP17有實際的分子作用，且親和力較好的12種化合物，在茶樹揮發(fā)物及鮮葉成分研究中都有大量報道[35]。在茶樹自然生長條件下?lián)]發(fā)的化合物，往往在害蟲寄主定位中發(fā)揮嗅覺吸引和驅避的作用[36-37]。任倩倩等研究表明，健康茶樹釋放一定量的揮發(fā)性物質，但種類和含量都較低，害蟲為害誘導會產生順-β-羅勒烯、DMNT、芳樟醇、法尼烯等10種主要揮發(fā)物[38]。這些物質可吸引天敵控制害蟲[39]。EnouOBP17除與DMNT無分子間的相互作用外，與其他物質都有較好的結合。推測EnouOBP17主要在寄主定位中發(fā)揮作用，在天敵逃避行為中可能發(fā)揮一定的作用。

在蘋果蠹蛾、桔小實蠅等多種害蟲研究中，應用分子對接技術研究氣味結合蛋白與揮發(fā)物化合物間的結合能力和結合模式，為驅避劑和引誘劑的篩選提供理論基礎已得到實踐[40-41]。

3.2" 結論

本文利用MOE軟件，探究了小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白EnouOBP17與13種食誘劑成分的結合能力和結合模式，結果表明：EonuOBP17與12種食誘劑成分有較好的結合能力，僅與DMNT結合較弱；EnouOBP17可以作為食誘劑進一步篩選的靶標蛋白。并探明了EonuOBP17蛋白與化合物分子作用的氨基酸位點情況。研究結果為小貫小綠葉蟬氣味結合蛋白分子識別機制研究和食誘劑的廣泛篩選提供了新路徑。

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（責任編輯：丁志祥）