男性煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動脈粥樣硬化關系

［摘要］ 目的 探討男性煙依賴者CDH23基因位點甲基化改變及其與頸動脈粥樣硬化發生的關系。

方法

選取青島某三甲醫院健康查體男性130例作為研究對象，有煙依賴史者64例納入煙依賴組，無煙依賴史者66例納入對照組。應用問卷調查方式搜集兩組研究對象一般資料，包括年齡、受教育程度、既往疾病史、煙依賴史等；采用彩色多普勒超聲儀器檢測頸動脈內膜厚度；采集血樣標本，檢測CDH23基因位點甲基化數值；分析男性煙依賴者CDH23基因位點甲基化改變及其與頸動脈粥樣硬化的關系。

結果 煙依賴組和對照組一般資料包括年齡、文化程度、既往疾病史比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）；煙依賴組CpG246、CpG48兩個位點的甲基化程度低于對照組，差異有統計學意義（t=－2.454、－2.436，Plt;0.05）；CpG246、CpG48位點甲基化水平與頸動脈內膜厚度相關（F=6.235、4.692，Plt;0.05），低甲基化水平時頸動脈內膜厚度顯著大于高甲基化水平。

結論 煙依賴者CDH23基因CpG位點發生低甲基化改變，這種低甲基化改變與頸動脈粥樣硬化發生密切相關。

［關鍵詞］ 煙草對健康的危害；CDH23基因；甲基化；動脈粥樣硬化；細胞黏附

［中圖分類號］ R543.5;R163

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0159－04

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.008

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

調查顯示，中國吸煙人群數量仍較多。煙依賴是慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、動脈粥樣硬化的獨立危險因素。CDH23基因編碼的鈣黏附素23，是鈣黏附素超家族中的典型成員，介導鈣離子依賴的細胞間和細胞內黏附。一項對中國煙依賴人群的全基因組檢測結果顯示，煙依賴人群細胞黏附分子（鈣黏附素23）與煙依賴相關。DNA甲基化是基因組的表觀遺傳修飾，參與調控基因表達和基因組穩定性。尼古丁是導致動脈粥樣硬化的獨立危險因素。煙依賴者是否存在CDH23基因位點硬化發生相關，目前尚無相關文獻報道。本文從臨床角度驗證煙依賴是否會導致CDH23基因位點甲基化狀態改變，并進一步探究這種甲基化狀態改變是否與頸動脈粥樣硬化的發生相關。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取青島某三甲醫院健康查體的男性130例作為研究對象，有煙依賴史者64例納入煙依賴組，無煙依賴史者66例納入對照組。所有研究對象納入標準：①男性，居住地長期住戶且年齡≥45歲；②煙依賴者與對照者之間排除血緣關系；③過去1年間無除尼古丁以外的濫用物質史；④獲得知情同意。煙依賴組入組標準：①符合美國精神障礙診斷統計手冊第四版（DSM－IV）關于物質依賴的診斷標準；②在過去1年內每天吸煙≥10支，吸煙≥2年或戒煙lt;3個月。對照組入組標準：①無煙依賴史或者明顯被動煙依賴史，在入組前總計吸煙量＜5支；②無定期使用任何尼古丁替代品（例如尼古丁貼片、尼古丁口香糖等）或其他煙草制品（如電子煙、雪茄等）。排除標準：①有除尼古丁以外的濫用物質史（如藥物、乙醇等）；②有某種精神疾病（如抑郁、精神分裂癥等）或病史；③嚴重心腦疾病等多臟器功能障礙或無法配合臨床量表調查者。本研究得到青島大學附屬醫院倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 由經過專業培訓的老年醫學科醫師，采用問卷調查方式收集研究對象一般資料，包括年齡、受教育年限、煙依賴史（初始吸煙年齡、每日吸煙數量、吸煙持續時間、戒煙時間等）、既往疾病史；應用尼古丁依賴量表（FTND）評估煙依賴者對煙草的依賴程度。既往疾病史包括高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病史，其診斷根據相關文獻的標準。

1.2.2 頸部血管超聲檢查 應用GE LOGIQ E9型彩色多普勒超聲檢查設備，由同一人進行頸動脈超聲檢查，記錄研究對象頸動脈內膜厚度。根據2009年《血管超聲檢查指南》標準，頸動脈內－中膜厚度（IMT）lt;1.0 mm 為正常，IMT≥1.0 mm為內－中膜增厚。

1.2.3 CDH23基因甲基化檢測 采集受試對象空腹外周靜脈血5 mL，放入EDTA抗凝管中，再提取管中血樣1 mL放入EP管中，－80 ℃冰箱保存。CDH23基因甲基化檢測由上海天昊生物科技有限公司完成，檢測流程：①樣品質控；②引物設計與單位點PCR條件優化；③多重PCR引物panel優化；④重亞硫酸鹽處理；⑤樣本目標片段多重PCR反應；⑥樣本添加特異性標簽序列；⑦定量后上機測序，最終于Illumina Hiseq平臺上，以2×150 bp的雙端測序模式進行高通量測序，獲得基因位點甲基化原始數據。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。應用Shapiro－Wilk’s方法進行正態性檢驗，符合正態分布計量資料以±s表示，兩組數據間比較采用t檢驗，多組數據比較采用析因設計方差分析；計數資料以頻數（頻率）表示，兩組數據比較應用χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組間平均年齡、受教育年限比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05）；兩組間高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。見表1。煙依賴組初始吸煙年齡（24.06±7.48）歲，持續時間（31.45±9.36）年，每日吸煙量（20.73±9.92）支，FTND評分（6.38±1.30）分。

2.2 兩組CDH23基因甲基化位點差異比較

CDH23基因啟動子存在4個完整的CpG島，分別為CDH23－1、CDH23－2、CDH23－3、CDH23－4，其中CDH23－1包含24個CpG位點，CDH23－2包含17個CpG位點，CDH23－3包含12個CpG位點，CDH23－4包含13個CpG位點。檢測兩組共計66個位點甲基化值，結果顯示煙依賴組CDH23－1片段中的CpG246位點、CDH23－2片段中的CpG48位點甲基化水平低于對照組，差異有統計學意義（t=－2.454、－2.436，Plt;0.05）。見表2。煙依賴組CDH23－1片段中的CpG110、CpG112、CpG127、CpG131、CpG135、CpG139、CpG147、CpG156、CpG162、CpG170、CpG191、CpG195、CpG200、CpG222、CpG224位點，CDH23－2片段的CpG36、CpG38、CpG43、CpG57、CpG60、CpG62、CpG64、CpG88、CpG101、CpG140、CpG152、CpG185位點，CDH23－3片段中的CpG50、CpG52、CpG62、CpG80、CpG91、CpG98位點，CDH23－4片段中的CpG33、CpG55、CpG89、CpG138、CpG166、CpG192、CpG208等40個位點甲基化程度均低于對照組，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。

2.3 兩組CDH23基因片段甲基化程度差異比較

以CDH23－1、CDH23－2、CDH23－3、CDH23－4所包含的位點的平均甲基化程度作為該片段的平均甲基化程度，煙依賴組各片段的平均甲基化程度均低于對照組，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。

2.4 煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動脈粥樣硬化關系

根據CpG246、CpG48位點甲基化中位數（分別為0.010 556、0.056 351），將研究對象分為高甲基化組和低甲基化組，根據研究對象是否煙依賴分為煙依賴組和非煙依賴組，利用析因設計方差分析兩種因素（煙依賴和基因位點甲基化）與頸動脈內膜厚度的關系，結果顯示，CpG246位點、CpG48位點甲基化水平與頸動脈內膜厚度相關，低甲基化水平時頸動脈內膜厚度顯著大于高甲基化水平（F=6.235、4.692，Plt;0.05）。見表3、4。

3 討 論

CDH23基因位于染色體10q22.1上，其編碼的鈣黏附素23是鈣黏附素超家族中的一員，鈣黏附素是一種跨膜糖蛋白，參與細胞間、細胞內黏附及細胞增殖、信號轉導等功能。既往研究認為，CDH23基因甲基化及多態性改變在聽力異常、癌癥和阿爾茨海默病中發揮作用，近年也有研究發現鈣黏附素23與煙依賴也密切相關。蛋白表達受基因調控，CDH23基因甲基化改變是否與煙依賴相關目前尚不清楚，CDH23基因甲基化水平是否與頸動脈粥樣硬化相關尚需進一步探討。

本研究對CDH23基因位點的甲基化水平進行了檢測，結果顯示煙依賴組CpG246位點、CpG48位點甲基化水平低于對照組，差異有統計學意義，表明煙依賴可能導致CDH23基因位點發生低甲基化改變。有研究表明，70%的GpG島位于啟動子區域，在此區域內甲基化程度與基因表達程度相反，因此推測基因甲基化水平的降低可導致CDH23基因表達的增加，其編碼的鈣黏附素23表達增加，細胞間的黏附功能增強。HUAN等研究發現，許多與吸煙相關的頂級差異表達基因（包括LRRN3和GPR15）在啟動子區域都有發生DNA甲基化改變的位點，這些位點在吸煙者中呈現低甲基化改變；隨后他們將這些差異表達基因位點與吸煙相關的疾病進行關聯分析，結果顯示這些基因位點與腦血管疾病及肺部慢性疾病（慢性阻塞性肺疾病、支氣管炎等）的發生顯著相關。

本文研究進一步結合研究對象煙依賴情況分析CpG246、CpG48兩個位點低甲基化水平與頸動脈內膜厚度的關系，結果顯示CpG246、CpG48兩個位點低甲基化水平時頸動脈內膜厚度顯著高于高甲基化水平，推測煙依賴人群中CpG246、CpG48位點的低甲基化水平與頸動脈粥樣硬化相關。鈣黏附素23介導細胞內和細胞間的黏附，相關研究表明，其主要在神經視網膜、耳蝸和前庭毛細胞的立體纖毛等部位表達，同時也在腦、心、血管、肺、腎、鼻、眼等細胞內皮上廣泛表達。目前研究認為，頸動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，細胞黏附分子作

為關鍵的成員參與了單核巨噬細胞的聚集、泡沫細胞的形成等環節。尼古丁被認為是煙依賴的主要物質及香煙致病的主要物質，既往研究表明尼古丁可誘導血管內皮細胞功能障礙，促使內皮細胞黏附分子異常表達。細胞黏附異常是動脈粥樣硬化發生的始動環節。CDH23基因位點低甲基化改變導致細胞內皮上鈣黏附素23表達增加，加強了細胞間的黏附，從而參與了動脈粥樣硬化的發生。

此前有大量的研究結果表明，異常的DNA甲基化改變包括異常的低甲基化和高甲基化，在動脈粥樣硬化內皮細胞功能障礙、巨噬細胞炎癥、血管平滑肌細胞異常增殖、斑塊破裂和血栓形成中發揮關鍵作用。ISTAS等通過綜合網絡數據分析發現，BRCA1和CRISP2 DMRs為大多數中心疾病相關的DNA甲基化生物標志物，這種差異甲基化BRCA1和CRISP2區域通過焦磷酸測序檢測得到驗證，并可在動脈粥樣硬化病人的血液、主動脈組織和頸動脈斑塊材料中進一步復制。本研究結果顯示，煙依賴者CDH23基因CpG位點發生低甲基化改變，這種低甲基化改變與頸動脈粥樣硬化發生密切相關。但本文僅對研究對象外周血樣本進行甲基化檢測，結果不能完全代表研究對象動脈粥樣硬化血管內皮上發生的事件，因此需要進一步取得病人的病理組織標本進行研究以驗證本文結論。同時本文樣本量相對較少，仍需擴大樣本量進一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉）