進展期胃腺癌組織ANOS-1表達與病人臨床病理特征及預后的關系

［摘要］ 目的 探討Anosmin－1（ANOS－1）在進展期胃腺癌組織中的表達變化及其與胃腺癌病人臨床病理特征和預后的關系。

方法 應用免疫組織化學法檢測118例胃腺癌及相應癌旁組織中ANOS－1的表達水平，分析ANOS－1在99例進展期胃腺癌組織中的表達與病人臨床病理特征及預后的關系；另從中隨機選取40例有淋巴結轉移的進展期胃腺癌病人，檢測相應淋巴結轉移灶中ANOS－1的表達水平。

結果 與相應癌旁組織相比，ANOS－1在118例胃腺癌組織中的表達水平顯著升高（Z=－8.278，Plt;0.001）。ANOS－1的表達水平與進展期胃腺癌的浸潤深度、淋巴結轉移、脈管侵犯、TNM分期相關（χ2=6.558～26.455，Plt;0.05）。與進展期胃腺癌原發(fā)灶相比，相應淋巴結轉移灶中ANOS－1的表達水平顯著升高（Z=－5.786，Plt;0.001）。ANOS－1高表達的進展期胃腺癌病人的總生存期和無病生存期均較低表達病人明顯縮短（P=0.004、0.002）；在浸潤深度為T3～T4、脈管侵犯陰性以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的病人中，ANOS－1表達水平越高，總生存期越短。Cox多因素分析顯示，ANOS－1表達水平是影響進展期胃腺癌病人總生存期和無病生存期的獨立預后因素。

結論 ANOS－1在進展期胃腺癌組織中表達增強可能與腫瘤侵襲、轉移以及預后不良有關，是進展期胃腺癌病人的獨立預后因素。

［關鍵詞］ 胃腫瘤；腺癌；Anosmin－1；疾病特征；預后

［中圖分類號］ R735.2;R365

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0168－06

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.058

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［ABSTRACT］ Objective To investigate the change in anosmin－1 （ANOS－1） expression in advanced gastric adenocarcinoma， and its relationship with clinicopathological features and prognosis of patients.

Methods Immunohistochemistry was used to determine the expression of ANOS－1 in 118 cases of gastric adenocarcinoma and corresponding paracancerous tissues. The relationship of ANOS－1 expression with the clinicopathological features and prognosis of patients was analyzed in 99 cases of advanced gastric adenocarcinoma. In addition， 40 patients with advanced gastric adenocarcinoma and lymph node metastasis were randomly selected from these patients， and the expression of ANOS－1 in the corresponding lymph node metastasis was measured.

Results Compared with corresponding paracancerous tissues， gastric adenocarcinoma tissues had a significantly higher expression level of ANOS－1 （Z=-8.278，Plt;0.001）. The expression level of ANOS－1 was associated with the depth of invasion， lymph node metastasis， vascular invasion， and TNM stage of advanced gastric adenocarcinoma （χ2=6.558-26.455，Plt;0.05）. Compared with the primary lesions of advanced gastric adenocarcinoma， the corresponding lymph node metastases had a significantly higher expression level of ANOS－1 （Z=-5.786，Plt;0.001）. Compared with those with low ANOS－1 expression， patients with high ANOS－1 expression had significantly shorter overall survival and disease－free survival （P=0.004，0.002）. In addition， in patients with T3-T4 invasion depth， negative vascular invasion， and TNM stage Ⅲ-Ⅳ， the higher the expression level of ANOS－1， the shorter the overall survival time. The Cox multivariate analysis showed that the expression level of ANOS－1 was an independent prognostic factor affecting the overall survival and disease－free survival of patients with advanced gastric adenocarcinoma.

Conclusion The increased expression of ANOS－1 in advanced gastric adenocarcinoma may be associated with tumor invasion， metastasis， and poor prognosis. ANOS－1 is an independent prognostic factor for advanced gastric adenocarcinoma.

［KEY WORDS］ stomach neoplasms; adenocarcinoma; Anosmin－1; disease attributes; prognosis

胃腺癌是一種威脅人類健康的常見的惡性腫瘤。在我國，胃腺癌是癌癥相關性死亡的第二大原因。不同地區(qū)的胃腺癌發(fā)病率有較大差異，其中發(fā)病率最高的是東北亞（如日本、韓國和中國）的男性，每10萬人中有69例罹患胃腺癌。由于胃腺癌早期癥狀不明顯而且侵襲轉移能力較強，因此預后較差。胃腺癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移過程涉及一系列分子機制的改變，但其具體機制目前尚不十分明確。因此，探討胃腺癌發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移的可能機制，以及尋找預后評估的有效標志物具有重要的臨床意義。

Anosmin－1（ANOS－1）是一種由KAL1基因編碼的細胞外基質（ECM）相關分泌糖蛋白，在早期腦發(fā)育過程中促進促性腺激素釋放激素（GnRH）神經(jīng)元從嗅覺基板向下丘腦遷移，影響初級和次級嗅覺處理區(qū)域的發(fā)育。有研究結果表明，ANOS－1與多種惡性腫瘤，如結腸癌、肺癌和卵巢癌等密切相關，其異常表達與腫瘤細胞的生長、轉移及預后不良有關。有研究表明，進展期胃腺癌病人癌組織中ANOS－1 mRNA和血清中ANOS－1的表達水平明顯高于正常人群。但該蛋白在進展期胃腺癌組織中的表達情況及與病人預后的關系尚未見報道。本研究應用免疫組織化學方法，檢測ANOS－1蛋白在進展期胃腺癌及相應淋巴結轉移灶組織中的表達水平，分析其表達與病人臨床病理特征的關系及對生存預后的影響，旨在探討ANOS－1在胃腺癌發(fā)生發(fā)展過程及預后評估中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本及其來源

于青島大學附屬醫(yī)院病理科選取2014—2015年的胃腺癌及相應癌旁組織（距腫瘤邊緣≥5 cm，其中慢性淺表性胃炎74例，慢性萎縮性胃炎44例）標本118例，其中進展期胃腺癌標本99例；另從中隨機選取40例有淋巴結轉移的進展期胃腺癌病人相應淋巴結轉移灶組織。所有入選病例臨床病理資料均完整，術前均未接受過放化療及其他相關治療。臨床分期按AJCC第八版分期標準，腫瘤分化程度按世界衛(wèi)生組織（WHO）分級標準進行評判。對所有99例進展期胃腺癌病人定期進行生存隨訪，隨訪時間截至2020年12月31日。本研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準且所有病人及家屬均知情同意。

1.2 組織芯片制作

所有胃腺癌及相應癌旁組織的切片經(jīng)兩名病理醫(yī)師復診確認后，在對應的蠟塊上選擇明確的癌組織及相應癌旁組織的部位；用孔徑為2 mm細針對受體蠟塊進行打孔，在供體蠟塊標記的相應部位采集組織芯，將其移至受體蠟塊的孔中，構建含有118例胃腺癌及相應癌旁組織的組織陣列蠟塊，按4 μm厚度對組織陣列蠟塊進行連續(xù)切片。組織芯片經(jīng)蘇木精－伊紅（HE）染色后，再由病理醫(yī)師確認。

1.3 免疫組織化學染色

采用PV－6000法對組織芯片切片進行染色。蠟塊切片、脫蠟、水化后，滅活內源性過氧化物酶，高壓熱抗原修復（EDTA，pH值＝8.0），滴加ANOS－1抗體（ABN486，Millipore，Darmstadt，Germany， 1∶100），37 ℃孵育2 h，滴加二抗（PV－6000購于北京中杉金橋生物技術有限公司），37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，封片。以ANOS－1陽性的腦組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷

ANOS－1的陽性表達定位于細胞質，判讀方法和標準參考相關文獻。按胞質染色強度和陽性細胞百分比進行計分，兩者分值的乘積為總評分。總評分≤2分為低表達，＞2分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。胃腺癌組織與相應癌旁組織之間以及原發(fā)灶與淋巴結轉移灶之間ANOS－1的表達比較采用Wilcoxon秩和檢驗；采用χ2檢驗分析ANOS－1表達與病人臨床病理特征的關系；采用Kaplan－Meier生存分析法（Log－rank檢驗）進行生存分析；進展期胃腺癌病人獨立預后因素分析應用Cox回歸模型，變量篩選方法采用向前步進法（LR）。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ANOS－1在胃腺癌組織及相應癌旁組織中的表達比較

胃腺癌及相應癌旁組織中ANOS－1主要表達于細胞質（圖1）。在118例胃腺癌組織中，ANOS－1高表達者75例，低表達者43例；而在相應癌旁組織中，3例呈高表達，115例呈低表達。與相應癌旁組織相比，ANOS－1在胃腺癌組織中的表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（Z=－8.278，Plt;0.001）。在74例慢性淺表性胃炎癌旁組織中，ANOS－1高表達者1例，低表達者73例；在44例慢性萎縮性胃炎癌旁組織中，2例ANOS－1呈高表達，42例ANOS－1呈低表達。ANOS－1在不同類型癌旁組織中的表達差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 ANOS－1在進展期胃腺癌原發(fā)灶與相應淋巴結轉移灶中的表達比較

選取40例有淋巴結轉移的進展期胃腺癌標本，其中24例ANOS－1在原發(fā)灶中呈高表達，31例在淋巴結轉移灶中呈高表達，二者表達差異具有統(tǒng)計學意義（Z=－5.786，Plt;0.001）。見圖1。

2.3 進展期胃腺癌組織中ANOS－1表達與病人臨床病理特征的關系

浸潤深度為T3～T4、有淋巴結轉移、有脈管侵犯、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的進展期胃腺癌病人癌組織中ANOS－1高表達率分別顯著高于浸潤深度為T2、無淋巴結轉移、無脈管侵犯、TNM分期為Ⅱ期的病人（χ2=6.558～26.455，Plt;0.05），ANOS－1表達水平與病人的性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關（P＞0.05）。見表1。

2.4 ANOS－1表達與進展期胃腺癌病人術后生存時間的關系

對99例進展期胃腺癌病人進行生存分析，結果顯示，ANOS－1高表達病人的總生存期、無病生存期中位數(shù)分別為35、20個月，低表達病人分別為43、35個月，ANOS－1高表達病人總生存期和無病生存期較低表達者更短（P=0.004、0.002）（圖2A～B）。在TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的病人中，ANOS－1高表達病人的總生存期中位數(shù)為32個月，低表達病人為43個月，ANOS－1表達水平越高總生存期越短（P=0.003）（圖2C）；而在浸潤深度為T3～T4的病人中，ANOS－1高表達病人的總生存期中位數(shù)為35個月，低表達病人的總生存期中位數(shù)為46個月，ANOS－1表達水平越高總生

存期越短（P=0.030）（圖2D）；在脈管侵犯陰性的病人中，ANOS－1高表達病人的總生存期中位數(shù)為40個月，低表達病人的總生存期中位數(shù)為44個月，ANOS－1表達水平越高總生存期越短（P=0.020）（圖2E）。

2.5 進展期胃腺癌病人獨立預后影響因素的Cox回歸分析

將進展期胃腺癌病人的性別（女=參照）、年齡（lt;60歲=參照）、分化程度（中分化=參照）、腫瘤大小（直徑lt;5 cm=參照）、浸潤深度（T2=參照）、TNM分期（Ⅱ期=參照）、淋巴結轉移（陰性=參照）、脈管侵犯（陰性=參照）以及ANOS－1表達（低表達=參照）等臨床病理特征納入Cox回歸模型，進行獨立預后影響因素分析。單因素回歸分析結果表明，ANOS－1表達、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度、脈管侵犯和分化程度對進展期胃腺癌病人總生存期的影響差異有統(tǒng)計學意義，ANOS－1表達、TNM分期、淋巴結轉移、分化程度、脈管侵犯對進展期胃腺癌病人無病生存期的影響差異有統(tǒng)計學意義。多因素回歸分析結果表明，ANOS－1表達水平和TNM分期是影響進展期胃腺癌病人總生存期和無病生存期的獨立預后因素，ANOS－1高表達病人的死亡風險和復發(fā)風險為低表達病人的3.658倍和4.769倍，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期病人的死亡風險和復發(fā)風險是TNM分期為Ⅱ期病人的6.749倍和7.294倍。見表2、3。

A：ANOS－1表達與進展期胃腺癌病人總生存期的關系；B：ANOS－1表達與進展期胃腺癌病人無病生存期的關系；C：ANOS－1表達與Ⅲ～Ⅳ期進展期胃腺癌病人總生存期的關系；D：ANOS－1表達與浸潤深度T3～T4進展期胃腺癌病人總生存期的關系；E：ANOS－1表達與脈管侵犯陰性進展期胃腺癌病人總生存期的關系。

3 討 論

ANOS－1的編碼基因KAL1定位于人染色體Xp22.3上，全長67 kbp，最早由LEGOUIS等于1991年在Kallmann綜合征病人體細胞中發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白質產(chǎn)物為ANOS－1，主要定位于細胞質內，分子量為76 000。在分子結構上，ANOS－1由1個包含N端信號肽、富半胱氨酸區(qū)、乳清酸性蛋白樣四－二硫核心的結構域，4個相鄰的纖連蛋白樣Ⅲ型結構域以及1個富含組氨酸的C端組成。ANOS－1高表達于大腦嗅球表面的嗅神經(jīng)層，在視網(wǎng)膜、脊髓和腎臟中也有一定程度表達。在早期腦發(fā)育過程中ANOS－1促進了GnRH神經(jīng)元及嗅球表面嗅鞘細胞的分化成熟，調控GnRH神經(jīng)元及嗅鞘細胞從嗅覺基板向下丘腦的遷移，從而影響初級和次級嗅覺處理區(qū)域的發(fā)育。

ANOS－1與腫瘤關系的相關研究較少。2009年有研究顯示，ANOS－1在結腸癌、肺癌和卵巢癌組織中的表達明顯上調；2015年KANDA等研究表明，進展期胃腺癌組織ANOS－1 mRNA的表達水平明顯高于相應癌旁組織，但該蛋白在進展期胃腺癌組織中的表達情況及其與病人預后的關系尚未見報道。本研究應用免疫組織化學方法檢測結果顯示，ANOS－1蛋白在胃腺癌組織中的表達水平顯著高于相應癌旁組織，與上述研究結果相一致，提示ANOS－1過表達可能是胃腺癌進展過程中發(fā)生的一個特定分子事件。

有研究結果顯示，ANOS－1在進展期結腸癌中的表達隨著臨床分期的提高而逐步增加，在低氧條件下結腸癌細胞的ANOS－1表達水平也明顯提高，并且隨著其表達水平的提高，腫瘤細胞的遷移數(shù)量增加。有研究結果表明，ANOS－1的相關基因與ITGAV、FOXC2以及NODAL等基因存在著共表達，而上述基因的蛋白產(chǎn)物是介導腫瘤細胞失黏附過程的重要轉錄因子。QI等的研究也發(fā)現(xiàn)，ANOS－1蛋白的高表達會刺激結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移。上述結果表明，ANOS－1可以增強腫瘤細胞的侵襲與遷移能力。本研究結果顯示，ANOS－1在進展期胃腺癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、脈管侵犯及TNM分期等臨床病理特征存在顯著相關性，在腫瘤浸潤深度為T3～T4、有淋巴結轉移、有脈管侵犯以及TNM分期晚的病人中ANOS－1的表達水平更高。本研究還分析了ANOS－1在進展期胃腺癌原發(fā)灶與淋巴結轉移灶中的表達情況，結果顯示，與進展期胃腺癌原發(fā)灶相比，相應淋巴結轉移灶中ANOS－1的表達水平顯著升高。這些結果提示，ANOS－1在胃腺癌侵襲和淋巴結轉移過程中發(fā)揮了重要作用，參與了胃腺癌的進展過程。但是ANOS－1影響胃腺癌侵襲轉移的可能分子機制仍需在今后的研究中進一步探討。

本研究結果顯示，進展期胃腺癌病人中ANOS－1蛋白高表達者的總生存期及無病生存期較低表達者更短。KANDA等的研究結果也顯示，胃腺癌病人血清ANOS－1表達水平明顯高于正常人群，且表達水平越高的病人總生存期及無病生存期越短。本研究結果還顯示，在TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度為T3～T4以及脈管侵犯陰性的進展期胃腺癌病人中，ANOS－1表達水平越高，總生存期越短。提示在TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度為T3～T4以及脈管侵犯陰性的進展期胃腺癌病人中，ANOS－1高表達者可能較低表達者有著更差的預后，ANOS－1的表達水平可能有助于臨床工作中對有不同臨床病理特征的胃腺癌病人的預后情況做出較準確的判斷。Cox回歸模型分析結果顯示，ANOS－1表達水平和腫瘤的TNM分期是影響進展期胃腺癌病人術后總生存期和無病生存期的獨立預后因素。以上結果提示，癌組織中ANOS－1的高表達與進展期胃腺癌預后差密切相關。因此，ANOS－1可能成為一種用于評估進展期胃腺癌病人術后生存期的潛在分子標志物。

綜上所述，ANOS－1在進展期胃腺癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用，其高表達與病人術后預后不良相關，ANOS－1在判斷胃腺癌病人的預后方面有潛在應用價值。但是由于本實驗僅在蛋白層面上對ANOS－1的表達情況與進展期胃腺癌病人臨床病理特征以及預后的關系進行探討，并不能對ANOS－1在胃腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的具體生物學作用及其分子機制作出更深層次的說明，因此仍需要通過分子生物學的實驗方法在分子病理層面進行進一步研究，以便提供新的理論依據(jù)更好地指導胃腺癌的診斷和靶向治療。

［參考文獻］

CHEN W Q， ZHENG R S， BAADE P D， et al. Cancer statis－tics in China， 2015." CA： A Cancer Journal for Clinicians，2016，66（2）：115－132.

FERLAY J， COLOMBET M， SOERJOMATARAM I， et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018： GLOBOCAN sources and methods." International Journal of Cancer， 2019，144（8）：1941－1953.

SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2016." CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2016，66（1）：7－30.

FERNNDEZ－FERNNDEZ F J， SESMA P. Gastric cancer." Lancet （London， England）， 2009，374（9701）：1594－1595.

GONZLEZ－MARTNEZ D， KIM S H， HU Y L， et al. Anosmin－1 modulates fibroblast growth factor receptor 1 signaling in human gonadotropin－releasing hormone olfactory neuroblasts through a heparan sulfate－dependent mechanism." The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2004，24（46）：10384－10392.

JIAN B X， NAGINENI C N， MELETH S， et al. Anosmin－1 involved in neuronal cell migration is hypoxia inducible and cancer regulated." Cell Cycle， 2009，8（22）：3770－3776.

KIM H C， KIM Y S， OH H W， et al. Collagen triple helix repeat containing 1 （CTHRC1） acts via ERK－dependent induction of MMP9 to promote invasion of colorectal cancer cells." Oncotarget， 2014，5（2）：519－529.

QI L， ZHANG W J， CHENG Z Q， et al. Study on molecular mechanism of ANOS1 promoting development of colorectal cancer." PLoS One， 2017，12（8）：e0182964.

KANDA M， SUH Y S， PARK D J， et al. Serum levels of ANOS1 serve as a diagnostic biomarker of gastric cancer： a prospective multicenter observational study." Gastric Can－cer， 2020，23（2）：203－211.

KANDA M， SHIMIZU D， FUJII T， et al. Function and diagnostic value of Anosmin－1 in gastric cancer progression." International Journal of Cancer， 2016，138（3）：721－730.

KANDA M， SUGIMOTO H， NOMOTO S， et al. Clinical utility of PDSS2 expression to stratify patients at risk for recurrence of hepatocellular carcinoma." International Journal of Oncology， 2014，45（5）：2005－2012.

KANDA M， SUGIMOTO H， NOMOTO S， et al. B－cell translocation gene 1 serves as a novel prognostic indicator of hepatocellular carcinoma." International Journal of Oncology， 2015，46（2）：641－648.

LEGOUIS R， HARDELIN J P， LEVILLIERS J， et al. The candidate gene for the X－linked Kallmann syndrome encodes a protein related to adhesion molecules." Cell， 1991，67（2）：423－435.

MACCOLL G， BOULOUX P， QUINTON R. Kallmann syndrome： adhesion， afferents， and anosmia." Neuron， 2002，34（5）：675－678.

CHOY C， KIM S H. Biological actions and interactions of anosmin－1." Frontiers of Hormone Research， 2010，39：78－93.

CHOY C T， KIM H， LEE J Y， et al. Anosmin－1 contributes to brain tumor malignancy through integrin signal pathways." Endocrine－Related Cancer， 2014，21（1）：85－99.

MATSUSHIMA S， SHIMIZU A， KONDO M， et al. Anosmin－1 activates vascular endothelial growth factor receptor and its related signaling pathway for olfactory bulb angiogenesis." Scientific Reports， 2020，10（1）：188.

HU Y L， BUTTS T， POOPALASUNDARAM S， et al. Extracellular matrix protein anosmin－1 modulates olfactory ensheathing cell maturation in chick olfactory bulb development." European Journal of Neuroscience， 2019，50（9）：3472－3486.

GOLDEN D， CANTLEY L G. Casein kinase 2 prevents me－

senchymal transformation by maintaining Foxc2 in the cytoplasm." Oncogene， 2015，34（36）：4702－4712.

HOLLIER B G， TINNIRELLO A A， WERDEN S J， et al. FOXC2 expression links epithelial－mesenchymal transition and stem cell properties in breast cancer." Cancer Research， 2013，73（6）：1981－1992.

KONG B， WANG W B， ESPOSITO I， et al. Increased expression of Nodal correlates with reduced patient survival in pancreatic cancer." Pancreatology： Official Journal of the International Association of Pancreatology （IAP）， 2015，15（2）：156－161.

DE SOUZA VIANA L， AFFONSO R J Jr， SILVA S R M， et al. Relationship between the expression of the extracellular matrix genes SPARC， SPP1， FN1， ITGA5 and ITGAV and clinicopathological parameters of tumor progression and colo－

rectal cancer dissemination." Oncology， 2013，84（2）：81－91.

YANG X M， YOU H Y， LI Q， et al. CTHRC1 promotes human colorectal cancer cell proliferation and invasiveness by activating Wnt/PCP signaling." International Journal of Clinical and Experimental Pathology， 2015，8（10）：12793－12801.

TAN F， LIU F， LIU H， et al. CTHRC1 is associated with peritoneal carcinomatosis in colorectal cancer： a new predictor for prognosis." Medical Oncology （Northwood， London， England）， 2013，30（1）：473.

（本文編輯 馬偉平）