miR-146a-5p及miR-9-3p對炎癥反應及脂代謝調節因子的作用

【摘要】 "目的 "通過檢測microRNA-146a-5p（miR-146a-5p）、microRNA-9-3p（miR-9-3p）對HepG2細胞白介素受體相關激酶-1（interleukin receptor-associated kinase-1，IRAK-1）、ATP結合盒轉運蛋白A1（ATP-binding gassette transporter A1，ABCA1）蛋白水平表達的影響，探討miR-146a-5p及miR-9-3p對炎癥反應及脂代謝調節因子作用。方法 "以HepG2細胞為試驗對象，分別進行miR-146a-5pmimics 轉染及miR-9-3pmimics轉染，采用Western blot檢測miR-146a-5p對HepG2細胞IRAK-1蛋白表達的影響及miR-9-3p對HepG2細胞ABCA1蛋白水平表達的影響。結果 "miR-146a-5p轉染組IRAK-1蛋白水平顯著低于對照組；miR-9-3p轉染組ABCA1的蛋白水平顯著低于對照組，差異均具有統計學意義（P=0.001）。結論 "miR-146a-5p能夠顯著下調HepG2細胞IRAK-1蛋白表達，miR-9-3p能夠顯著下調HepG2細胞ABCA1的蛋白表達，miR-146a-5p及miR-9-3p可能在炎癥反應調節及脂質代謝中起到重要的作用。

【關鍵詞】 "microRNA-146a-5p；microRNA-9-3p；白介素受體相關激酶-1；ATP結合盒轉運蛋白A1；蛋白免疫印跡

中圖分類號 "R587.1 " "文獻標識碼 "A " "文章編號 "1671-0223（2023）04--03

糖尿病是一種代謝性疾病，其中高糖環境下體內炎癥反應以及糖脂代謝往往是相互影響的，有研究顯示，在體內高糖水平下炎癥反應調節因子及脂代謝調節因子會發生表達水平的改變，影響體內正常炎癥調節及脂質代謝調節[1-3]。在循環系統中的微小核糖核酸（microRNA，miRNA），其中因子之一miR-146a-5p具有炎癥反應相關因子的調節作用。研究人員在糖尿病患者外周血細胞中進行檢測，發現其外周血細胞中的miR-146a-5p表達水平是顯著下降的[4-5]。循環系統中的miR-9-3p是一類參與代謝過程的miRNA，在體內的葡萄糖及脂類代謝過程中發揮作用，糖脂代謝紊亂與胰島素抵抗及胰島素水平分泌減少相關[6-7]。IRAK-1因子經研究證明其具有參與炎癥反應過程的調節因子，通過調節免疫因子表達[8-9]發揮擴大炎癥反應的作用。ABCA1是介導膽固醇逆轉運的重要調節因子，能夠在膽固醇代謝過程中發揮重要的調節作用。

本研究通過檢測miR-146a-5p對IRAK-1蛋白表達的影響，miR-9-3p對ABCA1蛋白表達的影響，探討miRNA對于炎癥反應及脂代謝調節的作用。

1 "材料與方法

1.1 "實驗材料

HepG2細胞系由中國協和醫科大學基礎研究所細胞中心提供。實驗分為三組，miR-146a-5p轉染組：細胞系進行轉染miR-146a-5p mimics；miR-9-3p轉染組：細胞系進行轉染miR-9-3p mimics；對照組：細胞系體外培養不進行轉染實驗，培養條件與各轉染組相同。每組實驗設兩組副孔，實驗重復兩次取均值。

1.2 "細胞培養

將凍存的細胞進行復蘇，細胞復蘇后的試管使用滴管緩慢加入適量的DMEM培養液（含有10%胎牛血清），將細胞稀釋成105/ml的濃度，之后緩慢轉移至預先消毒的培養瓶之中，并且將培養瓶放置于濃度為37%的CO2環境的培養箱內進行進一步培養，24h后進行更換培養液操作，將培養瓶放置于倒置顯微鏡之下進一步觀察細胞形態，細胞生長形態良好，待細胞生長達到鋪滿瓶壁即可傳代。

1.3 "細胞轉染

將配制好的miR-146a-5pmimics、miR-9-3pmimics轉染復合物，各吸取出250μl，分別緩慢的加入到已經培養好的細胞孔板中，再緩慢的吸取Opti-MEM培養基，達到750μl/孔，輕輕加入到細胞培養板的各孔中。轉染過程中要輕柔的搖勻細胞板至各細胞孔板混合均勻。緩慢轉移，將細胞培養板置于溫度為37℃、濃度為5.0﹪CO2、飽和濕度的培養箱中培養24h。在轉染時間達到6h后緩慢的吸取體積為1ml普通的DMEM培養基，其中DMEM中含有比例為20%胎牛血清、并且無抗生素成分，緩慢加入各孔。

1.4 "Western blot細胞總蛋白的提取

細胞轉染完成后，輕柔的應用PBS清洗3次，再應用RIPA裂解，裂解細胞進一步獲得細胞中總蛋白成分。再應用考馬斯亮藍方法測定所提取的蛋白濃度，后進行SDS-PAGE電泳，電泳實驗結束后取目的蛋白條帶，在恒流200mA條件下進行轉膜1h。轉膜實驗完成后，將膜用TBST水清洗，放入封閉液中，并且在搖床上封閉1h。按比例為1∶100或1∶200的比例進行配制一抗與一抗稀釋液。將封閉好的膜輕柔放入按上述比例配好的一抗稀釋液中，在溫度為4℃的環境中進行搖床過夜。按1∶1000或1∶2000的比例進行配制二抗與二抗稀釋液，緩慢的將膜放入按上述比例配好的二抗稀釋液，溫度為常溫在搖床上輕柔勻速搖3h。二抗孵育完成后，經TBST洗3次，加顯色液并且在凝膠成像系統顯色，并仔細記錄實驗結果。

1.5 "數據分析方法

應用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 統計軟件對實驗數據進行統計分析及作圖。正態分布的計量資料使用“±s”表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗。Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2 "結果

2.1 "miR-146a-5p對HepG2 細胞IRAK-1蛋白水平的影響

miR-146a-5p轉染組IRAK-1蛋白表達水平為0.528±0.074，對照組IRAK-1蛋白表達水平0.733±0.051，miR-146a-5p轉染組顯著低于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 "miR-9-3p對HepG2細胞 ABCA1蛋白水平的影響

miR-9-3p轉染組ABCA1的蛋白水平為0.505±0.073，對照組ABCA1的蛋白水平0.719±0.095，miR-9-3p轉染組ABCA1蛋白水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

3 "討論

在人體血液循環、組織液、淚液等循環系統中存在大量miRNA，目前的研究表明miRNA是一類非編碼的單鏈小RNA分子，其功能是調節體內多種蛋白類物質的表達。在生長發育期及疾病過程等相對非穩態時，miRNA表達水平會發生明顯的變化，發揮其調整蛋白質表達的作用，在穩定狀態下，其表達量也相對穩定，這就為研究疾病時miRNA表達水平奠定基礎。目前的研究報道提示，在疾病狀態下，細胞中miRNA會釋放入血或過量代謝，使血漿中miRNA的變化要早于蛋白類標記物[10]，以上特點使血漿miRNA具有成為全新疾病檢測標記物的潛能。

miR-146a-5p在目前的研究中證實其具有免疫調節功能，在促進炎癥修復以及抑制慢性炎癥反應發揮重要的作用[11-12]，糖尿病患者體內長期處于一種慢性的低度炎癥反應的狀態，慢性炎癥過程能夠加速線粒體凋亡，導致胰島細胞壞死，減少胰島素分泌，炎癥反應還能夠促進胰島素抵抗[13]。糖尿病模型小鼠其胰島β細胞內檢測顯示miR-146a-5p表達水平顯著升高，進一步研究其功能顯示，過量表達miR-146a-5p能夠促進炎癥反應。人類的IRAK-1基因位于Xq28位點，在機體自身免疫中通過激酶激活一系列炎癥因子，造成細胞炎癥以及組織損傷[14]。目前科學家通過研究證實，小鼠通過IRAK-1基因敲除技術進行研究顯示，其發生膿毒血癥以及腦脊髓炎的幾率能夠顯著降低，證明在小鼠體內IRAK1低水平表達，是防止炎癥進一步放大的防護調節機制[15-16]。但miR-146a-5p是否對HepG2細胞中IRAK-1因子表達水平產生抑制作用目前尚未見報道，本研究顯示miR-146a-5p轉染組IRAK-1蛋白水平顯著低于對照組，說明miR-146a-5p在蛋白水平對IRAK-1進行調節，能夠通過降低IRAK-1水平抑制細胞炎癥反應，如患者循環中miR-146a-5p表達水平發生變化，其調節炎癥反應相應發生變化，可通過檢測miR-146a-5p直接檢測體內炎癥反應變化情況。

miR-9-3p是一類參與代謝過程的miRNA，目前研究報道在機體的葡萄糖及脂類代謝過程中發揮作用。ABCA1膜轉運蛋白是介導膽固醇逆轉運的關鍵因子[17]。研究報道，如將巨噬細胞ABCA1表達水平顯著下調，能夠導致細胞膽固醇外流水平顯著下降[18-19]，使膽固醇水平升高，脂質代謝紊亂。報道顯示，在apoE受體基因敲除的小鼠中，其巨噬細胞中所表達的ABCA1顯著下調，小鼠發生動脈粥樣硬化的幾率顯著增加，并且程度是較重的 [20]。因此研究糖脂代謝相關miR-9-3p與膽固醇逆轉運相關ABCA1之間表達水平的關系，能夠從基因層面深入闡述糖尿病患者發生膽固醇代謝紊亂其調節異常的真正原因。本研究發現miR-9-3p轉染組HepG2細胞ABCA1蛋白水平顯著低于對照組，提示miR-9-3p通過蛋白水平參與ABCA1基因的表達調控，高水平的miR-9-3p能夠導致膽固醇代謝紊亂，可通過檢測循環中miR-9-3p水平反應體內膽固醇代謝情況。

本實驗證實miR-146a-5p能夠抑制細胞炎癥因子IRAK-1蛋白表達，miR-9-3p抑制細胞脂質調節因子ABCA1蛋白表達，為miRNA相關炎癥反應及脂質調節的機制提供理論依據。

4 "參考文獻

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[2022-12-15收稿]