自噬對激素性股骨頭壞死大鼠的作用效果分析

屈肖肖 喬慶陽 陳寧 宋同陽 李瑜 劉樹義

1西安醫學院臨床醫學院（西安710021）；2西安醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉科（西安710038）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由于激素長期或過量使用導致股骨頭出現骨小梁減少、股骨頭塌陷的一種疾病。患者通常以髖部疼痛、髖關節活動障礙為主要臨床表現，嚴重者出現癱瘓［1］。SANFH 多累及雙側股骨頭，目前除全髖關節置換術外，尚無有效的治療方法。行手術治療后可能面假體松動、使用壽命、假體周圍骨折、感染等并發癥［2］。因此，探索SANFH 的防治策略是臨床亟待解決的難題。目前對SANFH 的研究較為廣泛，其中脂質代謝紊亂學說的關注度較高。研究表明，激素可使機體內血脂升高，股骨頭內出現脂滴堆積現象，進而出現股骨頭壞死［3］，而應用他汀類藥物可改善高血脂和股骨頭壞死發生率［4-5］。但這仍無法滿足臨床治療需求，其預防機制和方法仍需進一步探究。本研究通過構建SANFH 大鼠模型，給予自噬干預后觀察股骨頭壞死、血脂及血管內皮改善情況，為臨床尋找防治SANFH 的新方法。

1 材料與方法

1.1 研究材料本研究實驗動物SD 大鼠18 只（SPF 級）購自西安交通大學醫學部實驗動物中心，雌、雄各9 只，平均體質量為（241.37 ± 10.45）g。脂多糖（LPS，貨號：L8880）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，貨號：IM0190）、雷帕霉素（Rapamycin，貨號：R8140）購自北京索萊寶科技有限公司；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/瓶）購自輝瑞制藥有限公司。LC3Ⅱ/Ⅰ（貨號：14600-1-AP）、p62（貨號：18420-1-AP）抗體購自Proteintech 公司。內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、一氧化氮（NO）等ELISA 試劑盒均購自美國R＆D 公司。本研究經西安醫學院生物醫學科學研究倫理委員會批準（倫理審批號：XYLS2022110）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及動物模型制備大鼠進入動物中心后，適應性飼養1 周，采用隨機數字表法分為3 組：模型組（M 組）、自噬阻斷組（M-3-MA 組）及自噬激動組（M-Rap 組），每組6只，雌、雄各半。3組大鼠經腹腔注射LSP（20 μg/kg）2 次，每次間隔24 h，然后兩側臀肌交替注射甲潑尼龍（40 mg/kg），每周3 次，每次間隔24 h，持續4 周。M-3-MA 組與M-Rap 組每次肌肉注射甲潑尼龍前30 min，經腹腔分別注射3-MA（2.5 mg/kg）、雷帕霉素（1 mg/kg）。停止給予甲潑尼龍后繼續飼養4 周，腹主動脈采血、收集雙側股骨頭標本。

1.2.2 股骨頭壞死表面積測量股骨頭壞死表面積測量方法參考趙鳳朝等［6］使用的“坐標紙粘貼法”。具體為：將壞死股骨頭切成層厚為5 mm 薄片，粘帖于坐標紙上并瞄記其范圍，采用Leica 圖像分析儀計算實際面積。

1.2.3 血脂測定經腹主動脈采血2 mL 于促凝管中，離心制備血清，采用自動生化儀三聯酶法檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.2.4 血清eNOS、NO及內皮素1（ET-1）含量測定采用ELISA 法測定血清中eNOS、NO 及ET-1 含量。按照試劑盒說明書進行樣品制備，加入酶標抗體孵育，待反應終止后，采用全自動多功能酶標儀，于波長450 nm 處測定各孔吸光度值（OD值），繪制標準曲線，計算各組大鼠血清eNOS 和ET-1 含量。

1.2.5 Western blot 檢測LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表達量股骨頭組織稱重后置于組Ⅰ織研磨機中，將股骨頭研磨為勻漿狀，加入配置好的組織裂解液后置于冰上裂解，每個5 min 渦旋1 次，30 min 后置于高速離心機離心，吸取取上清液后采用BCA 法進行蛋白定量。配制10%分離膠進行凝膠電泳，100 V恒壓濕轉90 min。使用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，裁取目的蛋白條帶并加入GAPDH（1∶1 000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）及p62（1∶1 000）抗體溶液，4 ℃搖床孵育過夜。第2天用PBST洗膜4次×5 min后加入二抗（1∶20 000，HRP 標記）溶液，室溫孵育1 h。PBST 洗滌4 次后，瀝干膜表面水分，浸于ECL 化學發光液中，3 min 后將條帶鋪于膠片夾內，于暗室內進行曝光、顯影。應用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法實驗數據采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠自噬活性評價結果比較與M 組比較，自噬干預后，M-3-MA 組大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達量降低，而p62 蛋白表達量增加，M-Rap 組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達量增加，而p62 蛋白表達量降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表達情況Fig.1 Protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰand p62 in femoral head tissue of rats in each group

2.2 各大組鼠股骨頭壞死情況比較3 組大鼠股骨頭均發生了壞死，M 組、M-3-MA 及M-Rap 組發生率分別為66.7%（4/6）、100%（6/6）、33.33%（2/6），且各組組內雌、雄鼠之間股骨頭壞死率差異無統計學意義（P＞0.05）。與M 組比較，M-3-MA 組大鼠股骨頭壞死面積更廣泛，而M-Rap 組平均股骨頭壞死面積更小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

表1 3 組大鼠股骨頭壞死表面積比較Tab.1 Comparison of femoral head necrosis surface area among three groups±s

表1 3 組大鼠股骨頭壞死表面積比較Tab.1 Comparison of femoral head necrosis surface area among three groups±s

組別M 組（n = 6）M-3-MA 組（n = 6）M-Rap 組（n = 6）F 值P 值股骨頭壞死［例（%）］4（66.7）6（100）2（33.3）股骨頭壞死表面積（mm2）左（L）1.61 ± 0.17 2.56 ± 0.34 1.06 ± 0.21 17.121 0.001右（R）1.33 ± 0.22 1.98 ± 0.10 1.02 ± 0.10

圖2 3 組大鼠股骨頭標本Fig.2 Rat femoral head specimens of three groups

2.3 各組大鼠血脂情況比較與M 組相比，自噬干預后M-3-MA 組大鼠血漿中TG、TCH 及LDL 水平升高而HDL 水平下降，M-Rap 組血漿中TG、TCH及LDL 水平下降而HDL 水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組大鼠血脂情況比較Tab.2 Blood lipids of rats in three groups were compared ±s，mmol/L

表2 3 組大鼠血脂情況比較Tab.2 Blood lipids of rats in three groups were compared ±s，mmol/L

注：與M 組比較，#P ＜0.05

組別M 組（n = 6）M-3-MA 組（n = 6）M-Rap 組（n = 6）F 值P 值TG 1.85 ± 0.08 2.47 ± 0.15#1.19 ± 0.14#16.516＜0.05 TCH 4.36 ± 0.31 5.29 ± 0.23#3.16 ± 0.10#14.372＜0.05 HDL 1.82 ± 0.07 1.03 ± 0.11#2.85 ± 0.12#15.228＜0.05 LDL 0.52 ± 0.11 1.98 ± 0.09#0.28 ± 0.08#15.814＜0.05

2.4 各組大鼠血漿eNOS、ET-1 含量比較與M組相比，自噬干預后M-3-MA 組大鼠血清eNOS、NO 含量降低而ET-1 升高，M-Rap 組大鼠血清eNOS、NO 含量升高而ET-1 下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3 組大鼠血清eNOS、NO 及ET-1 含量比較Tab.3 Comparison of serum eNOS，NO and ET-1 contents among three groups±s

表3 3 組大鼠血清eNOS、NO 及ET-1 含量比較Tab.3 Comparison of serum eNOS，NO and ET-1 contents among three groups±s

注：與M 組比較，#P ＜0.05

組別M 組（n = 6）M-3-MA 組（n = 6）M-Rap 組（n = 6）F 值P 值eNOS（U/mL）26.13 ± 3.21 20.32 ± 2.64#35.78 ± 3.13#22.367＜0.05 NO（μmol/L）21.38 ± 6.53 14.49 ± 9.62#30.72 ± 6.17#30.536＜0.05 ET-1（pg/mL）52.41 ± 6.82 68.92 ± 6.76#38.55 ± 7.56#27.284＜0.05

3 討論

SANFH的發病與代謝、凝血等多重因素有關［7］，隨著研究深入脂質代謝紊亂成為了SANFH 研究的焦點。研究表明，激素可誘發高脂血癥進而使得脂質在全身多個部位出現沉積，部分脂滴會以胞飲的形式進入組織細胞，形成細胞內“占位”效應，在股骨頭內引發髓內高壓、滋養血管閉塞、靜脈回流受阻等變化，最終導致細胞功能受損、死亡［8-9］。在SANFH 動物模型中發現，激素不僅能夠削弱成骨細胞的作用，而且能增加股骨頭髓內脂肪的生成，而阿托伐他汀類等藥物能夠改善激素誘發的脂質沉積［10-11］。此外激素進入機體后，可與血液中未乳化的脂蛋白球結合形成脂肪栓子，進而隨血液循環堵塞外周血管［12-13］，引發組織缺血性壞死。因此，在長期、大量使用激素過程中若給予恰當、有效的機體脂代謝調節措施，理應能降低股骨頭壞死的發病率。2009年，SINGH 等［14］首次發現自噬能夠調節細胞內脂質儲量，揭示了脂質代謝過程中自噬的關鍵作用，并將這一現象命名為“脂肪噬”（lipophagy）。近年來的研究表明，脂質吞噬作用在許多不同類型的細胞中起作用，是細胞脂質代謝的常見途徑［15］，適當利用細胞內的“脂肪噬”現象，可以作為治療脂肪肝等細胞內有脂質堆積的疾病的方法［16］。基于上述研究結果，推測自噬干預可能是治療SANFH 的新方向。

為驗證研究假設，本研究構建了SANFH大鼠模型，并同時給予自噬干預，觀察自噬干預對SANFH大鼠股骨頭壞死的改善情況。結果顯示，未實施自噬干預的大鼠股骨頭壞死率為66.7%，平均壞死面積為（1.47 ± 0.19）mm2，給予自噬抑制劑后，大鼠股骨頭組織細胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白明顯下降、p62 蛋白明顯升高，股骨頭壞死發生率為100%，壞死表面積為（2.27 ± 0.22）mm2，而當給予自噬激活劑時，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白明顯升高、p62蛋白明顯下降，股骨頭壞死發生率僅為33.33%，壞死表面積為（1.04 ± 0.15）mm2。這些結果表明，自噬干預的確在一定程度上能降低股骨頭壞死的發生率，且局限了病灶范圍。

為進一步明確自噬干預效果是否與脂質代謝、血管內皮改善有關，本研究評估了每組大鼠血脂和血清eNOS、NO、ET-1 含量。結果顯示，使用激素后大鼠的脂代謝出現了輕度異常，且使用3-MA 抑制自噬后，TG、TCH、LDL 水平明顯升高，HDL 水平明顯下降，而使用雷帕霉素激活自噬后，TG、TCH、LDL 水平明顯降低，HDL 水平明顯升高，接近于正常值。此外，自噬干預后血清eNOS、NO及ET-1 含量同樣出現了顯著變化。與未實施自噬干預的大鼠相比，自噬活性被抑制的大鼠血清中eNOS、NO 含量明顯降低，且ET-1 含量明顯升高，而自噬活性被激活的大鼠eNOS、NO 含量明顯升高，且ET-1 含量明顯降低。眾所周知，eNOS、NO是內皮損傷后進行修復并維持血管擴張狀態最為重要的物質，對股骨頭的滋養血管也十分重要。而ET-1 是內皮損傷后釋放入血的一種縮血管物質，易使諸多滋養動脈出現閉塞。這些結果表明，自噬干預是通過調節脂質代謝和促進因高血脂導致血管內皮損傷修復，從而改善大鼠股骨頭壞死情況。其機制在于：一方面血脂降低后，血液黏稠度下降，內皮損傷減輕，脂肪栓子減少或消失，脂質堆積減少或消失；另一方面自噬激活后，血管內皮釋放大量eNOS 等內皮修復物質，減少了ET-1 等縮血管物質，維持滋養血管良好灌注。

綜上所述，在激素進入機體并誘發SANFH 的過程中，脂質代謝紊亂發揮了關鍵作用，通過增強機體組織細胞自噬活性，可有效改善股骨頭壞死的發生率和局限病灶范圍。因此，誘導自噬可成為治療SANFH 的新方向。本研究未就自噬干預效應的分子機制作進一步探究，后續還需要開展相關實驗研究。

【Author contributions】QU Xiaoxiao：Conceptualization，Methodology，Writing original-draft.QIAO Qingyang：Methodology.CHEN Ning：Investigation.SONG Tongyang：Formal analysis.LI Yu：Resorces.LIU Shuyi：Conceptualization，Supervision，Validation，Writing Review and Editing.All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.